Tampilkan postingan dengan label Bioteknologi. Tampilkan semua postingan
Tampilkan postingan dengan label Bioteknologi. Tampilkan semua postingan
Selasa, 26 November 2013
Pengertian Metilasi DNA
Metilasi DNA adalah proses biologis dimana gugus metil, yang merupakan gugus fungsional organik dengan rumus CH3, ditambahkan ke nukleotida DNA. DNA, atau asam deoksiribonukleat, adalah asam nukleat penting yang menyimpan informasi genetik untuk setiap organisme tertentu. Hal ini terdiri dari empat molekul yang berbeda yang dikenal sebagai nukleotida, ini disebut sebagai adenin, sitosin, guanin,
Minggu, 22 September 2013
Apa Pengertian Hewan transgenik
Hewan transgenik adalah organisme yang telah dimodifikasi yang merupakan hewan genetik. Mereka telah dengan cara tertentu terjadinya perubahan materi genetik, untuk sejumlah alasan. Dalam beberapa kasus hewan transgenik dapat dirancang hanya untuk secara visual menarik, untuk mempelajari, untuk menghasilkan lebih banyak daging, atau untuk melakukan tugas tertentu yang lebih baik. Hewan transgenik
Sabtu, 14 September 2013
Mengenal Alat dari Bioteknologi
Proses dasar teknologi DNA rekombinan berkisar aktivitas DNA dalam sintesis protein. Selama sintesis ini, DNA menyediakan kode genetik untuk penempatan asam amino dalam protein. Dengan ikut campur dalam proses ini, para ilmuwan dapat mengubah sifat DNA, sehingga mengubah sifat protein diungkapkan oleh DNA itu. Dengan memasukkan gen ke dalam genom suatu organisme, ilmuwan dapat menimbulkan
Sabtu, 17 Agustus 2013
Apa Pengertian Bioteknologi Merah
Bioteknologi Merah adalah cabang dari bioteknologi yang khusus menangani kesehatan manusia dan metode pengobatan melalui pengembangan obat-obatan seperti antibiotik. Bidang ini juga dapat melibatkan penelitian manipulasi gen melalui rekayasa garis kuman pada tahap embrio atau terapi gen pada pasien dewasa. Fokus bioteknologi merah biasanya di sektor farmasi, di mana diperkirakan bahwa 80% dari
Sabtu, 22 Juni 2013
Sebutkan Pengertian Jenis Bioteknologi
Setiap aplikasi teknis yang menggunakan sistem biologi, organisme hidup atau turunannya untuk membuat atau memodifikasi produk untuk penggunaan tertentu adalah Bioteknologi. Beberapa teknik banyak digunakan adalah Genomics, rekayasa genetika, DNA / RNA sequencing, profil ekspresi gen, sintesis dan sekuensing protein, metode penyampaian ditingkatkan untuk obat molekul besar, proteomik,
Sejarah Menuju Kesuksesan Bioteknologi Modern
Jika saya pilih titik kronologis beberapa penemuan penting dalam biologi yang menyebabkan bioteknologi modern kemudian booming, Gregor Mendel asal Austria yang terkenal dipuncak grafik karena ia adalah orang pertama yang menggambarkan adanya ‘faktor’ (sekarang disebut sebagai gen) di belakang setiap karakter sifat . Kemudian para ilmuwan ingin tahu tentang "faktor" ini. Butuh waktu hampir
Minggu, 15 Mei 2011
Antibodi monoklonal
I. Pengertian Antibodi Monoklonal
adalah antibodi sejenis yang diproduksi oleh sel plasma klon sel-sel positif sejenis. Antibodi ini dibuat oleh sel-sel hibridoma (hasil fusi 2 sel berbeda; penghasil sel positif Limpa danselmieloma)yangdikultur.Bertindak sebagai antigen yang akan menghasilkan anti bodi adalah limpa. Fungsi antara lain diagnosis penyakit dan kehamilan.Antibodi monoklonal adalah zat yang diproduksi oleh sel gabungan tipe tunggal yang memiliki kekhususan tambahan. Ini adalah komponen penting dari sistem kekebalan tubuh. Mereka dapat mengenali dan mengikat ke antigen yang spesifik. Pada teknologi antibodi monklonal, sel tumor yang dapat mereplikasi tanpa henti digabungkan dengan sel mamalia yang memproduksi antibodi. Hasil penggabungan sel ini adalah hybridoma, yang akan terus memproduksi antibodi. Antibodi monoklonal mengenali setiap determinan yang antigen (bagian dari makromolekul yang dikenali oleh sistem kekepalan tubuh / epitope). Mereka menyerang molekul targetnya dan mereka bisa memilah antara epitope yang sama. Selain sangat spesifik, mereka memberikan landasan untuk perlindungan melawan patogen. Antibodi monoklonal sekarang telah digunakan untuk banyak masalah diagnostik seperti : mengidentifikasi agen infeksi, mengidentifikasi tumor, antigen dan antibodi auto, mengukur protein dan level drug pada serum, mengenali darah dan jaringan, mengidentifikasi sel spesifik yang terlibat dalam respon kekebalan dan mengidentifikasi serta mengkuantifikasi hormon.
II.Cara Memproduksi Antibodi Monoklonal (Hibridoma)
PENERAPAN ANTIBODI MONOKLONAL
Makrofag telah mengidentifikasikan sel kanker. Ketika melampaui batas menyatukan dengan sel kanker, makrofag (sel putih yang lebih kecil) akan menyuntikan toksin yang akan membunuh sel tumor. Imunoterapi untuk perawatan kanker merupakan salah satu hal yang diteliti oleh penelitian medis.
Peran penting imunitas lainnya adalah untuk menemukan dan menghancurkan tumor. Sel tumor menunjukan antigen yang tidak ditemukan pada sel normal. Untuk sistem imun, antigen tersebut muncul sebagai antigen asing dan kehadiran mereka menyebabkan sel imun menyerang sel tumor. Antigen yang ditunjukan oleh tumor memiliki beberapa sumber; beberapa berasal dari virus onkogenik seperti papillomavirus, yang menyebabkan kanker leher rahim, sementara lainnya adalah protein organisme sendiri yang muncul pada tingkat rendah pada sel normal tetapi mencapai tingkat tinggi pada sel tumor. Salah satu contoh adalah enzim yang disebut tirosinase yang ketika ditunjukan pada tingkat tinggi, merubah beberapa sel kulit (seperti melanosit) menjadi tumor yang disebut melanoma.Kemungkinan sumber ketiga antigen tumor adalah protein yang secara normal penting untuk mengatur pertumbuhan dan proses bertahan hidup sel, yang umumnya bermutasi menjadi kanker membujuk molekul sehingga sel termodifikasi sehingga meningkatkan keganasan sel tumor. Sel yang termodifikasi sehingga meningkatkan keganasan sel tumor disebut onkogen.
Respon utama sistem imun terhadap tumor adalah untuk menghancurkan sel abnormal menggunakan sel T pembunuh, terkadang dengan bantuan sel T pembantu. Antigen tumor ada pada molekul MHC kelas I pada cara yang mirip dengan antigen virus. Hal ini menyebabkan sel T pembunuh mengenali sel tumor sebagai sel abnormal Sel NK juga membunuh sel tumor dengan cara yang mirip, terutama jika sel tumor memiliki molekul MHC kelas I lebih sedikit pada permukaan mereka daripada keadaan normal; hal ini merupakan fenomena umum dengan tumor. Terkadang antibodi dihasilkan melawan sel tumor yang menyebabkan kehancuran mereka oleh sistem komplemen.
Beberapa tumor menghindari sistem imun dan terus berkembang sampai menjadi kanker.Sel tumor sering memiliki jumlah molekul MHC kelas I yang berkurang pada permukaan mereka, sehingga dapat menghindari deteksi oleh sel T pembunuh. Beberapa sel tumor juga mengeluarkan produk yang mencegah respon imun; contohnya dengan mengsekresikan sitokin TGF-β, yang menekan aktivitas makrofag dan limfosit. Toleransi imunologikal dapat berkembang terhadap antigen tumor, sehingga sistem imun tidak lagi menyerang sel tumor.
Makrofag dapat meningkatkan perkembangan tumor ketika sel tumor mengirim sitokin yang menarik makrofag yang menyebabkan dihasilkannya sitokin dan faktor pertumbuhan yang memelihara perkembangan tumor. Kombinasi hipoksia pada tumor dan sitokin diproduksi oleh makrofag menyebabkan sel tumor mengurangi produksi protein yang menghalangi metastasis dan selanjutnya membantu penyebaran sel kanker.
Antibodi monoklonal adalah kelompok obat yang relatif baru, dan pengembangan terapi ini merupakan salah satu kemajuan terbesar untuk pengobatan limfoma non Hodgkin dalam beberapa tahun belakangan. Antibodi monoklonal yang paling umum dipakai dalam pengobatan limfoma non Hodgkin adalah rituximab. Rituximab efektif dalam pengobatan beberapa tipe limfoma non Hodgkin yang paling umum. Rituximab umumnya diberikan dalam kombinasi dengan kemoterapi, meskipun pada beberapa keadaan diberikan tunggal.
Pada banyak pasien, rituximab meningkatkan efektivitas dari pengobatan lain (umumnya kemoterapi). Pada limfoma non Hodgkin indolen, rituximab dapat meningkatkan lamanya masa remisi karena pengobatan. Pada limfoma non Hodgkin agresif, tambahan rituximab pada kemoterapi standar (CHOP) telah terbukti meningkatkan kemungkinan pasien untuk sembuh dan meningkatkan harapan hidup dibanding kemoterapi saja.
Juga penting bahwa efek samping terkait infus rituximab umumnya hanya terjadi saat obat diberikan dan berkurang pada dosis berikutnya, serta pemberian bersamaan dengan kemoterapi tidak menyebabkan peningkatan efek samping karena kemoterapi yang bermakna. Efek samping yang berlanjut lebih lama dari beberapa menit atau jam sangat jarang dan umumnya tidak ada makna klinisnya .
CARA KERJA ANTIBODI MONOKLONAL
Tidak seperti kemoterapi dan radioterapi, yang bekerja secara kurang spesifik, tujuan pengobatan antibodi monoklonal adalah untuk menghancurkan sel-sel limfoma non Hodgkin secara khusus dan tidak mengganggu jenis-jenis sel lainnya.
Semua sel memiliki penanda protein pada permukaannya, yang dikenal sebagai antigen. Antibodi monoklonal dirancang di laboratorium untuk secara spesifik mengenali penanda protein tertentu di permukaan sel kanker. Antibodi monoklonal kemudian berikatan dengan protein ini. Hal ini memicu sel untuk menghancurkan diri sendiri atau memberi tanda pada siinduk kekebalan tubuh untuk menyerang dan membunuh sel kanker.
Sebagai contoh, rituximab, antibodi monoklonal yang dipakai dalam pengobatan limfoma non Hodgkin, mengenali penanda protein CD20. CD20 ditemukan di permukaan Sel B abnormal yang ditemukan pada jenis-jenis limfoma non Hodgkin yang paling umum.
Saat rituximab berikatan dengan CD20 di permukaan suatu sel-B, sel mungkin dihancurkan langsung, tetapi pertahanan alami tubuh juga disiagakan. Rituximab secara efektif menyerang sel limfoma agar dapat dihancurkan siinduk kekebalan tubuh dan membunuh sel-sel kanker.
CD20 juga ditemukan di permukaan sel-B normal, salah satu jenis sel darah putih yang beredar di tubuh. Ini berarti mungkin sel-B normal ini juga dihancurkan saat rituximab digunakan. Akan tetapi, sel induk dalam sumsum tulang yang berkembang menjadi sel-B tidak memiliki CD20 pada permukaannya.
Oleh karena itu sel induk tidak dihancurkan oleh rituximab dan dapat terus menyediakan sel-B sehat untuk tubuh. Meskipun jumlah sel-B normal yang matang berkurang untuk sementara karena pengobatan, mereka akan kembali ke kadar semula setelah pengobatan.
DOSIS DAN PEMBERIAN ANTIBODI
Dosis dan pemberian bervariasi untuk setiap antibodi yang diberikan. Sebagai contoh, rituximab, antibodi monoklonal yang umum digunakan dalam pengobatan NHL diberikan intravena, melalui jarum yang masuk ke dalam pembuluh darah , biasanya di lengan. Rituximab diberikan sebagai ‘tetesan’ yang berarti obat dimasukkan dulu ke dalam kantong infus, kemudian cairan menetes perlahan ke dalam pembuluh darah dengan mengandalkan kekuatan gravitasi. Jika antibodi monoklonal digunakan dalam kombinasi dengan kemoterapi, rituximab biasanya diberikan sesaat sebelum kemoterapi pada awal setiap siklus pengobatan.
Sebelum tetesan infus diberikan, obat lain untuk mencegah beberapa efek samping antibodi monoklonal diberikan – contohnya parasetamol untuk mengurangi demam dan anti-histamin untuk mengurangi kemungkinan reaksi alergi. Meski demikian, efek samping antibodi monoklonal umumnya ringan dan sementara serta dapat diatasi dengan mudah.
Jika terjadi efek samping saat obat diberikan, tetesan infus dapat diperlambat atau bahkan dihentikan hingga efek samping berakhir.
Untuk pengobatan pertama, pasien menginap di rumah sakit atau sementara tinggal di sana sebelum pulang ke rumah. Pengobatan lanjutan biasanya lebih cepat dan efek sampingnya lebih sedikit. Kebanyakan orang dapat mendapat pengobatan lanjutan ini sebagai rawat-jalan dan pulang ke rumah pada hari itu juga.
EFEK SAMPING ANTIBODI MONOKLONAL
Seperti semua obat, antibodi monoklonal dapat menyebabkan efek samping. Contohnya untuk rituximab, efek samping umumnya ringan dan bersifat sementara, hanya berlangsung selama pengobatan atau beberapa jam setelahnya. Efek samping terjadi paling sering selama masa pengobatan mingguan pertama, dan biasanya berkurang dengan dosis selanjutnya. Hal ini disebabkan lebih banyak sel limfoma selama pengobatan pertama yang harus diserang oleh antibodi monoklonal dan dihancurkan oleh si induk kekebalan tubuh.
Efek samping yang paling umum adalah demam, menggigil dan gejala mirip flu lainnya, seperti nyeri otot, nyeri kepala dan rasa letih. Umumnya cepat berakhir setelah masa pengobatan berakhir. Kadang-kadang, pasien merasakan flushing mendadak dan merasa panas di wajah. Hal ini biasanya berlangsung amat singkat.
Beberapa pasien mengalami mual (mual) atau muntah. Obat anti muntah (anti-muntah) umumnya sangat efektif dalam mencegah maupun meringankan gejala-gejala ini sehingga lebih dapat ditoleransi.
Kadang-kadang, pasien merasakan nyeri pada bagian tubuh yang merupakan lokasi limfoma. Nyeri biasanya ringan dan dapat diatasi dengan obat anti-nyeri biasa.
Rituximab dapat menyebabkan reaksi alergi. Gejalanya dapat berupa:
• Gatal atau mendadak muncul warna kemerahan
• Batuk, mengi atau sesak napas
• Lidah bengkak atau rasa bengkak di tenggorokan
• Edema, atau pembengkakan karena kelebihan cairan dalam jaringan tubuh
Reaksi alergi berat terhadap rituximab jarang ditemukan dan pasien diamati selama masa pengobatan akan munculnya gejala-gejala ini. Pasien harus melaporkan gejala yang dialaminya begitu muncul. Seringkali, yang perlu dilakukan hanyalah memperlambat atau menghentikan sementara tetesan intravena sampai reaksi alergi berakhir. Pasien umumnya diberikan anti-histamin sebelum mulai pengobatan untuk membantu mencegah atau mengurangi masalah ini.
MATERI
Terapi antibodi monoklonal merupakan bentuk pasif dari imunoterapi, karena antibodi dibuat dalam kuantitas besar di luar tubuh (di laboratorium). Jadi terapi ini tidak membutuhkan sistem imun pasien untuk bersikap aktif melawan kanker. Antibodi diproduksi secara masal dalam laboratorium dengan menggabungkan sel myeloma (tipe kanker sumsum tulang) dari sel B mencit yang menghasilkan antibodi spesifik. Sel hasil penggabungan ini disebut hybridoma.
Kombinasi sel B yang bisa mengenali antigen khusus dan sel myeloma yang hidup akan membuat sel hibridoma menjadi semacam pabrik produksi antibodi yang tidak ada habisnya. Karena semua antibodi yang dihasilkan identik, berasal dari satu (mono) sel hibridoma, mereka disebut antibodi monoklonal (kadang disingkat MoAbs atau Mabs).
Nama MAb Nama Dagang Digunakan pada kanker Disetujui
Rituximab Rituxan Non-Hodgkin lymphoma 1997
Trastuzumab Herceptin Breast cancer 1998
Gemtuzumab ozogamicin* Mylotarg Acute myelogenous leukemia (AML) 2000
Alemtuzumab Campath Chronic lymphocytic leukemia (CLL) 2001
Ibritumomab tiuxetan* Zevalin Non-Hodgkin lymphoma 2002
Tositumomab* Bexxar Non-Hodgkin lymphoma 2003
Cetuximab Erbitux Colorectal cancer
Head & neck cancers 2004
2006
Bevacizumab Avastin Colorectal cancer 2004
Dua tipe antibodi monoklonal yang digunakan untuk terapi kanker, adalah :
1. Naked monoclonal antibodies
Naked monoclonal antibodies atau antibodi monoklonal murni adalah antibodi yang penggunaanya tanpa dikombinasikan dengan obat lain atau material radioaktif. Antibodi murni mengikatkan diri mereka pada antigen spesifik milik sel-sel kanker dengan berbagai cara. Misalnya, memberi tanda pada sel kanker agar bisa dikenali dan dirusak oleh sistem imun tubuh. Cara lain dengan mengikatkan diri pada antigen tertentu yang disebut reseptor, tempat di mana molekul-molekul yang berfungsi menstimulasi pertumbuhan sel kanker juga akan mengikatkan diri.
Dengan menghambat molekul-molekul pertumbuhan untuk tidak mengikatkan diri, maka antibodi monoklonal ini sama saja mencegah sel kanker untuk tumbuh dengan cepat. Trastuzumab (Herceptin), yang merupakan MAb murni dan digunakan untuk kanker payudara stadium lanjut, adalah contoh antibodi monoklonal yang bekerja dengan cara ini.
Beberapa MAbs murni yang sudah disetujui FDA antara lain :
• Rituximab (Rituxan): Rituximab digunakan untuk terapi sel B pada non-Hodgkin lymphoma. Agen ini merupakan antibodi monoklonal dengan sasaran antigen CD20, yang ditemukan pada sel B.
• Trastuzumab (Herceptin): Trastuzumab adalah antibodi yang menyerang protein HER2. Protein ini terlihat dalam jumlah besar pada sel-sel beberapa kasus kanker payudara.
• Alemtuzumab (Campath): Alemtuzumab merupakan antibodi yang menyerang antigen CD52, yang terlihat pada sel B maupun sel T. Agen ini digunakan untuk terapi B cell lymphocytic leukemia (B-CLL) kronik yang sudah mendapat kemoterapi.
• Cetuximab (Erbitux): Cetuximab, antibodi dengan sasaran protein EGFR (epidermal growth factor receptors). EFGR nampak dalam jumlah besar pada beberapa sel kanker. Agen ini digunakan berbarengan dengan obat kemoterapi irinotecan untuk kanker kolorektal stadium lanjut.
• Bevacizumab (Avastin): Bevacizumab bekerja melawan protein VEGF (Vascular Endhotelial Growth Factor) yang normalnya membantu tumor membangun jaringan pembuluh darah baru (proses angiogenesis) sebagai satu cara mendapatkan oksigen dan nutrisi.
Efek Samping
Antibodi monoklonal diberikan intravena. Dibandingkan dengan efek samping kemoterapi, efek samping naked MAbs atau MAbs murni biasanya lebih ringan dan sering dikaitkan dengan reaksi “alergi”. Efek ini terlihat biasanya di awal terapi, misalnya demam, menggigil, lemah, nyeri kepala, mual, muntah, diare, tekanan darah turun, dan rashes. Beberapa MAbs juga bisa berimbas pada sumsum tulang seperti halnya pada pemberian obat kemoterapi. Hal ini sebagai akibat rendahnya kadar sel darah. Efek samping ini bisa memicu peningkatan risiko pendarahan dan infeksi pada pasien.
` 2. Conjugated Monoclonal Antibodies
Conjugated monoclonal antibodies adalahantibodi yang dikombinasikan dengan berbagai jenis obat, toksin, dan materi-materi radioaktif. Antibodi monoklonal jenis ini akan berkeliling ke seluruh bagian tubuh sampai ia berhasil menemukan sel kanker yang cocok dengan antigen yang ia bawa. Agen ini kemudian akan menghantarkan racun di tempat paling krusial, namun hebatnya, ia bisa meminimalkan dosis pada sel normal untuk menghindari kerusakan di seluruh bagian tubuh.
Conjugated MAbs kadang dikenal juga sebagai "tagged," "labeled," atau "loaded" antibodies. Perbedaannya sebagai berikut:
• MAbs yang dikombinasikan dengan obat-obat kemoterapi disebut chemolabeled. Saat ini agen ini hanya tersedia di Amerika Serikat, itupun hanya dalam rangka uji klinis.
• MAbs yang dikombinasikan dengan partikel radioaktif disebut radiolabeled, dan tipe terapi ini sering juga disebut radioimmunotherapy (RIT). Pada 2002, FDA menyetujui radiolabeled pertama yang boleh digunakan untuk terapi kanker (tak hanya untuk uji klinis) yakni Ibritumomab tiuxetan (Zevalin). Obat ini digunakan untuk terapi kanker B lymphocytes. Di samping untuk kanker, antibodi radiolabeled juga digunakan bersamaan dengan kamera khusus untuk mendeteksi penyebaran sel kanker dalam tubuh. Penggunaannya sudah disetujui FDA yakni OncoScint (untuk deteksi kanker kolorektal dan kanker ovarium) serta ProstaScint (deteksi kanker prostat).
• MAbs yang melekat dengan racun disebut immunotoxins. Imunotoksin dibuat dengan menempelkan racun-racun (berasal dari tanaman maupun bakteri) ke antibodi monoklonal. Berbagai racun dibuat untuk ditempelkan pada antibosi monoklonal seperti diphtherial toxin (DT), pseudomonal exotoxin (PE40), atau yang dibuat dari tanaman yakni ricin A atau saporin.
Imunotoksin lain yakni BL22, juga cukup menjanjikan melalui studi awal untuk terapi hairy cell leukemia, bahkan pada pasien yang tidak menunjukkan respon sama sekali dengan kemoterapi. Uji klinis imunotoksin juga tengah berlangsung untuk jenis leukemia tertentu, limfoma, kanker otak, dan kanker lainnya.
1. Kombinasi Growth Factors/Toksin
Ilmuwan juga melakukan eksperimen dengan racun yang ada kaitannya dengan substansi serupa hormon, yang sering disebut growth factors. Banyak sel-sel kanker memiliki reseptor growth factor dalam jumlah besar di permukaan sel yang akan menstimulasi sel untuk reproduksi dan tumbuh dengan cepat.
Peneliti lantas mengupayakan kombinasi gen sehingga growth factor bisa menempel pada toksin. Saat kombinasi growth factors/toksin mencapai reseptor growth factor pada permukaan sel kanker, dia akan menyalurkan muatan racun ke dalam sel kanker dan membunuhnya. Konsep di belakang obat gabungan growth factors/toksin ini mirip dengan imunotoksin. Namun karena kombinasi growth factors/toksin ini tidak mengandung antibodi, obat ini tidak bisa diklasifikasikan sebagai imunotoksin.
2. Chimeric, Langkah Maju Terapi Antibodi Monoklonal
Hingga kini, keefektifan terapi MAb masih terbatas mengingat fakta bahwa antibodi diproduksi oleh sel-sel hibridoma mencit. Di awal terapi, antibodi ini seringkali bekerja baik. Namun pada beberapa kasus, sistem imun mulai mengenali antibodi mencit ini sebagai “benda asing” setelah pemberian beberapa kali, dan mulai merusaknya saat “musuh” ini masuk ke dalam tubuh.
Karena alasan ini, ilmuwan mengkombinasikan antibodi mencit yang bertanggungjawab untuk mengenali antigen tumor spesifik dengan bagian gen antibodi manusia. Produk gabungan antara gen antibodi manusia dan mencit ini disebut “chimeric” atau "humanized" monoclonal antibody.
3. Anti-angiogenesis
Anti-angiogenesis adalah proses penghentian pembentukan pembuluh darah baru. Pada jaringan normal, pembuluh darah baru terbentuk selama pertumbuhan dan perbaikan jaringan (misalnya ketika proses penyembuhan luka), dan selama perkembangan janin di masa kehamilan. Pembuluh darah membawa oksigen dan nutrisi ke jaringan yang diperlukan untuk pertumbuhan dan bertahan hidup. Demikian juga pada kanker. Tumor membutuhkan pembuluh darah untuk tumbuh dan bertahan hidup. Melalui proses yang kompleks, sel-sel endotel (yang membentuk pembuluh darah) bisa membelah diri dan tumbuh membentuk pembuluh darah baru. Proses ini disebut angiogenesis. Proses ini terjadi baik pada jaringan sehat maupun pada jaringan kanker.
Beberapa agen anti-angiogenesis yang sudah dikenal seperti dilansir American Association For Cancer Research, antara lain:
Bevacizumab
Seperti dipaparkan di atas, bevacizumab adalah antibodi monoklonal dengan target sasaran protein vascular endothelial growth factor (VEGF). Mei 2003, dari hasil penelitian fase III menunjukkan bahwa bevacizumab secara bermakna bisa meningkatkan harapan hidup hingga hampir 5 bulan pada pasien kanker kolorektal stadium lanjut. Agen ini dikombinasikan dengan kemoterapi berbasis IFL (irinotecan, 5-fluorouracil, dan leucovorin). Selain itu, risiko kematian dapat dikurangi lebih dari sepertiga (34%) pada kelompok pasien penerima kombinasi bevacizumab dan IFL dibandingkan pasien yang hanya menerima kemoterapi.
Thalidomide
Efek angiogenesis thalidomide pertama kali dibuktikan pada tahun 50-an, ketika perempuan hamil yang mengonsumsi obat ini mengalami phicomelia, atau deformitas kaki akibat penghambatan pembentukan pembuluh darah. Meskipun mekanisme persisnya belum diketahui, para ahli menjelaskan efek ini didapat dengan menghambat aksi faktor penting angiogenesis seperti basic fibroblast growth factor dan vascular endothelial growth factor (VEGF).
α-IFN
α-IFN, merupakan sitokin yang memiliki properti anti-angiogenesis yang sangat berperan dalam aktivitas penyakit seperti hemangioma, melanoma, renal cell carcinoma, dan Kaposi’s sarcoma. Beberapa laporan mengindikasikan, kombinasi α-IFN dengan agen lain seperti thalidomide atau cis-retinoic acid akan menghadirkan efek anti-angiogenesis yang lebih kuat.
MMP Inhibitors
Matrix metalloproteinases (MMPs) termasuk keluarga zinc-dependent endopeptidases yang bertanggungjawab menurunkan dan merombak dasar membran dan matriks ektraseluler. MMPs memegang peran penting dalam tahap perkembangan metastatik dan juga memfasilitasi neo-angiogenesis. Overekspresi dari MMPs oleh tumor atau stroma yang berkaitan dengan tumor berdampak pada prognosis yang memburuk pada beberpa jenis kanker termasuk kanker esofagus, kolon, dan pankreas.
Tyrosine Kinase Inhibitors
Kabanyakan sel, tremasuk sel kanker, memiliki resptor di permukaan mereka sebagai epidermal growth factor (EGF), yakni protein yang normalnya diproduksi oleh tubuh untuk pertumbuhan sel. Jika EGF berikatan dengan epidermal growth factor receptors (EGFRs), menyebabkan enzim tyrosine kinase menjadi aktif di dalam sel. Tyrosine kinase adalah enzim yang berada di dalam sel yang berfungsi mengikat fosfat dengan tirosin asam amino. Tyrosine kinase memicu proses kimia yang menyebabkan sel –termasuk sel kanker—tumbuh, berlipat ganda, dan menyebar. Penghambat tyrosin kinase (tyrosine kinase inhibitors) dikembangkan untuk menghentikan pertumbuhan sel kanker. Dari berbagai studi yang sudah dilakukan menunjukkan penghambat ini menyebabkan kematian sel dengan cepat, karena mekanisme bertahan hidup ala kanker di-deaktivasi.
Pengembangan Teknik Produksi dan Aplikasi Antibodi
Monoklonal Ralstonia Solanacearum (RS)
Penyakit layu bakteri yang disebabkan Ralstonia solanacearum (Rs) masih menjadi kendala produksi tanaman pertanian, misalnya pada kacang tanah, kentang, tomat, tembakau, pisang dan jahe. Bakteri RS bersifat soil born dan polifaga ini mempunyai variasi strain yang tinggi, baik berdasarkan kisaran inangnya, tingkat virulensinya, maupun kemampuan memanfaatkan karbohidrat sebagai nutrisinya (Machmud 1996). Beberapa mikroba patogen penting lainnya pada tanaman pangan dan hortikultura juga telah dikoleksi dalam plasma nutfah mikroba di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian Bogor. Komponen antigenik dari mikroba tersebut akan digunakan untuk produksi antibodi bagi pengembangan kit ELISA untuk deteksi dini dan identifikasi serangan penyakit.
Teknik serologi dan model perangkatnya dengan menggunakan antibodi poliklonal (PAb)dan monoklonal telah banyak dikembangkan untuk deteksi dan identifikasi virus dan bakteri patogen utama tanaman. Meskipun teknik ini cukup efektif, namun penggunaannya dianggap masihsangat mahal karena perangkat kit ELISA-nya masih tergantung pada produk impor. Di samping itu juga tidak mampu untuk mendeteksi adanya variasi strain patogen yang ada di lapang yang berkembang dengan sangat cepat dan bersifat spesifik lokasi. Melalui pembuatan perangkat kit
ELISA sendiri, permasalahan tersebut dapat teratasi. Teknik dan perangkat yang akan dikembangkandiharapkan dapat dimanfaatkan oleh peneliti dan pengguna lainnya, baik untuk keperluanpenelitian maupun untuk penggunaan secara rutin dan praktis, misalnya deteksi dini patogen di lapang dan deteksi patogen dari benih untuk keperluan karantina dan sertifikasi benih (Machmudet al. 1999).
Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan salah satu teknik serologi yang dapat digunakan untuk mendeteksi patogen tanaman secara efektif dan efisien (Halk dan De Boer 1985). Teknik ELISA dan perangkat deteksinya menggunakan antibodi poliklonal (PAb) atau McAb telah dikembangkan.secara komersial untuk deteksi virus dan bakteri patogen tanaman(Martin 1985; Van Regenmortel 1986). Teknik ELISA juga telah diadopsi di Indonesia, tetapi perangkatnya masih harus diimpor dengan harga mahal. menggunakan PAb (Machmud et al.1999).
Penggunaan PAb untuk uji ELISA memiliki beberapa kelemahan, sehingga sejak tahun1975, teknologi produksi antibodi monoklonal (monoclonal antibody, McAb) telah dikembangkan (Kohler dan Milsten 1975; Carter dan Ter Meulen 1984; Gigerli dan Fries 1983). McAb dari PAb diantaranya (1) reaksi McAb dapat dibuat spesifik strain, dari satu patogen dapat dibuat beberapa McAb dengan spesifikasi tertentu sesuai kebutuhan; (2) antibodi yang dihasilkan mempunyai kualitas yang stabil serta berkesinambungan; (3) pasokan antibodi dalam jumlah besar mudah dilakukan, dan (4) teknologi McAb hanya modal awal yang relatif mahal, tetapi selanjutnya menjadi murah (Jordan 1990). McAb telah diproduksi untuk berbagai patogen tanaman termasuk virus, fitoplasma, dan bakteri (Converse dan Martin 1990; McLaughlin dan Chen 1990).
Pada tahun 1975 Kohler dan Milsten (dalam Jordan 1990a) memperkenalkan teknik pembiakan sel penghasil antibodi melalui fusi dengan sel mieloma, sehingga dapat menghasilkan antibodi yang homogen secara terus menerus, bereaksi serologi yang spesifik serta memiliki ciriciri biokomia tertentu pula. Hibridisasi sel-sel limposit penghasil antibodi dengan sel miolema (malignant myeloma cells) menghasilkan sel-sel hibridoma yang menggabungkan sifat-sifat parental dan kemampuan menghasilkan (mensekresi) antibodi yang spesifik dan terus tumbuh berkembangbiak. Kloning dan seleksi lebih lanjut sel-sel hibridoma memberi peluang diproduksinya mAb dengan spesifisitas yang sama (identik) dan efektifitas sesuai dengan yang diinginkan terhadap epitop tertentu pada antigen yang digunakan untuk imunisasi (Jordan 1990b). Akhirakhir ini teknik produksi mAb telah diadopsi untuk produksi mAb patogen tanaman. MAb telah digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi patogen tumbuhan termasuk virus, fitoplasma,dan bakteri (Converse dan Martin 1990; McLaughlin dan Chen 1990).
Kelebihan teknik produksi mAb dari teknik pAb di antaranya (1) mampu menghasilkan antibodi dalam jumlah relatif tidak terbatas, (2) kemampuan melestarikan produksi Ab yang spesisik melalui penyimpanan kriogenik hibridoma untuk waktu tidak terbatas, (3) kemampuan memproduksi dan menyeleksi mAb untuk hampir semua determinan antigenik meskipun antigen yang digunakan untuk imunisasi tidak murni atau merupakan campuran (Jordan 1990a dan 1990b; De Boer 1990). Teknologi hibridoma untuk produksi mAb telah diterapkan pada virologi dan bakteriologi tumbuhan. McAb sangat bermanfaat untuk identifikasi esei kualitatif bakteri dan virus tanaman, membedakan tingkat kesamaan antara anggota berbagai kelompok virus dan bakteri, serta mempelajari struktur dan fungsi produk gen (Converse dan Martin 1990).
Metodologi yang mencakup pembuatan galur sel (cell lines) yang menghasilkan mAb secara permanen relatif sederhana, tetapi memerlukan tahapan yang panjang dan seringkali sulit (crucial). Keberhasilan produksi mAb tidak hanya bergantung pada produksi galur sel hibridoma dalam jumlah banyak, tetapi juga pada keberhasilan imunisasi hewan donornya, pengetahuan dan pengalaman dasar tentang kultur sel (termasuk pembuatan medium, pemeliharaan, dan penyimpanan galur sel), dan pengembangan teknik serologi yang relatif sederhana, cepat, dan akurat untuk mengkarakterisasi dan mengidentifikasi antibodi. Penyediaan dan karakterisasi mAb untuk berbagai antigen tanaman dan patogen dapat dilakukan. Berbagai publikasi tentang teknik produksi mAb dapat digunakan sebagai bahan acuan (Jordan 1990a).
Hibridoma merupakan sel yang mudah rusak, memerlukan pengamatan mikroskopik untuk mengetahui viabilitas dan laju pertumbuhannya. Persyaratan lain untuk produksi McAb adalah antigen dan esei serologis yang digunakan untuk mengidentifikasi dan karakterisasi antibodi hibridoma. Sistem esei yang digunakan sangat tergantung pada jenis antigen dan rencana penggunaan McAb (Jordan 1990a).
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kelti Biokimia, BB-Biogen, Bogor. Peralatan dan bahan yang digunakan dalam penelitian di antaranya ialah ruang isolasi (laminar air flow), inkubator CO2 bersuhu 37oC, mikroskop (inverted microscope), sentrifus meja, otoklaf, waterbath 37- 56oC, alat penyimpanan kriogenik, alat kering beku (freeze dryer), pendingin (freezer) -15oC dan -80oC, hemasitometer, spektrofotometer, mikropipet 0-200 μl, mikropipet 1000 μl, multipipettor 8 lubang, filter milllipore ukuran 0,22 μm. Peralatan dan bahan untuk membiakkan sel hibridoma adalah cawan kultur sel (microplate) bertutup dengan 96 lubang; botol kultur sel berdiameter 25, 75, dan 150 cm; pipet gelas atau pipet plastik berukuran 1, 5, 10, dan 25 ml; ampul berukuran 1 ml; tabung sentrifus bertutup ukuran 5, 15, dan 50 ml; cawan petri bulat dan persegi, pipet pastur, sarung tangan plastik, spuit plastik berukuran 1, 10, dan 50 ml; jarum suntik berukuran 26G dan 16G, serta gunting operasi. Di samping peralatan laboratorium, mencit (tikus putih) hibrida Balb/c, serta ruangan dan kandang untuk pemeliharaannya juga diperlukan. Mencit sebagai hewan untuk diimunisasi dan sumber limposit. Bahan-bahan untuk pembuatan sediaan limposit, biakan sel mieloma, dan biakan sel hibridoma adalah Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), medium Hypoxanthine Aminopterine Thymidine (HAT), antibiotik kanamisin, serum albumin anak sapi yang baru lahir (Newly-borne Calf Serum, NBS), dan medium Hypoxanthine Thymidine (HT).
Penyediaan Antigen Contoh tanaman padi terinfeksi RTV dan RS diperoleh dari koleksi yang ada di Kelti Biokimia, BB-Biogen, yang semula berasal dari lapang di Sukamandi, Subang dan Serang.Pemurnian RTV dan RS dilakukan menggunakan teknik pemurnian menurut Saito (1983) yang dimodifikasi.
Imunisasi Mencit Mencit hibrida Balb/c yang diperoleh dari IPB, Bogor, digunakan untuk diimunisasi. Sediaan murni RS yang digunakan sebagai antigen diperoleh dari hasil pemurnian yang telah dilakukan sebelumnya. Antigen RS dilarutkan dalam bufer fosfat salin (Phosphate Buffered Saline, PBS), pH 7,2, dengan kepekatan 100 ug/ml. Sebelum imunisasi, antigen dicampur dengan Ajuvan Freund Inkomplit (Incomplete Freund’s Ajuvant, Sigma) dengan perbandingan 1 : 1. Imunisasi danbooster dilakukan sesuai dengan metode Harlow dan Lane (1988) dengan cara sebagai berikut: antigen RS diberikan secara intraperitonial (i.p) dengan dosis yang dilaporkan tidak mematikan tetapi imunogen (Dewanti-Hariyadi et al. 1998), yaitu 25 μg patogen/mencit. Mencit yang digunakan berumur 4-6 minggu dengan menyuntikkan 100 μl (10-20 ug) larutan antigen RS setiap kali secara intravenal, melalui vena ekor mencit, secara berkala dengan tenggang waktu satu minggu.Pada minggu 2, 3, 4, 5, dan 6 setelah imunisasi diberikan booster, yaitu penyuntikan dengan IFA (incomplete Freund’s adjuvant) secara intraperitonial (i.p). Tiga hari sebelum mencit disakritifikasi untuk diambil limfanya diberikan booster akhir secara intravena (IV) dengan konsentrasi 10 μg antigen/mencit.
Persiapan Sel Limposit dari Sel Limpa Mencit Hiperimun Persiapan sel limfosit dilakukan dengan metode Harlow dan Lane (1988) yang dimodifikasi.Mencit Balb/c yang sudah diinjeksi antigen RS serta sudah dibooster 4 kali dan diberi booster akhir secara i.v (umur 6 minggu setelah imunisasi) dimatikan dan direndam dalam alkohol 70%. Limpa diambil secara aseptik dan dicuci 3 kali dengan media DMEM tanpa serum. Cara lain yang juga dilakukan untuk mendapatkan sel limfosit adalah empat hari setelah imunisasi terakhir, 1 ml contoh darah diambil dari mencit yang telah diimunisasi, dipisahkan dan diuji kandungan (titer) antiserumnya menggunakan teknik mikropresipitasi. Apabila hasilnya positif dan titernya cukup tinggi, maka mencit dimatikan dan limpanya (spleen) diambil secara aseptik dan ditempatkan dalam cawan petri steril berisi 20 ml medium DMEM tanpa serum NBS (DMEM-NBS). Selanjutnya, secara aseptik pula, limpa yang masih utuh dan segar dipotong kecil-kecil untuk mengeluarkan sel limpa (limposit). Potongan-potongan limpa di tekan-tekan (diurut) menggunakan pinset untuk mengeluarkan limpositnya ke dalam medium. Suspensi limposit disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 7 menit dan peletnya dicuci dengan DMEM-NBS empat kali. Selanjutnya limposit disuspensikan kembali dengan 20 ml DMEM-NBS dan dihitung kerapatannya menggunakan hemasitometer. Pada percobaan ini digunakan lima ekor yang masing-masing diimunisasi dengan 100 ug antigen RS/injeksi.
Persiapan Sel Mieloma Pada hari ke-2 inkubasi, kondisi pertumbuhan, dan kerapatan sel biakan mieloma SP2 diperiksa. Diperkirakan dua hari ini sel mieloma tumbuh pada fase log. Contoh biakan diambil dari masing-masing cawan petri dan jumlah selnya dihitung menggunakan hemositometer. Bila jumlah sel yang dibutuhkan belum mencukupi, maka disediakan biakan baru dengan menumbuhkan sel mieloma yang telah ada dalam cawan petri yang berisi media baru. Pada hari ke-3 inkubasi, populasi sel mieloma diperiksa kembali dan dihitung kerapatannya, dan pada hari ke-4 inkubasi dilakukan fusi sel. Selanjutnya sel mieloma yang telah ditumbuhkan hingga fase pertumbuhan logaritmik disentrifusi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan disuspensikan kembali dalam 20 ml medium DMEM-serum free dengan volume tertentu dan kerapatan selnya dihitung dengan hemasitometer.
Fusi Limfosit dengan Mieloma Fusi dilakukan dengan cara mencampurkan sel mieloma dengan sel limfosit mencit, dengan perbandingan 10 : 1. Campuran sel disentrifusi dengan kecepatan 1000 rpm pada suhu kamar selama 7 menit. Selanjutnya supernatan dibuang. Ke dalam tabung berisi pelet sel fusan ditambahkan 1 ml larutan 50% polietilen glikol (PEG 4000) dalam DMEM-NBS, setetes demi setetes menggunakan pipet ukur 1 ml sambil digoyang. Penambahan tersebut, mulai dari tetesan pertama hingga tetesan terakhir, harus dilakukan dalam rentang waktu 60 detik. Tahapan pemberian PEG adalah sebagai berikut: detik ke-1 diteteskan satu tetes PEG, detik ke-10 satu tetes
PEG, detik ke-20 satu tetes PEG, detik ke-30 satu tetes PEG, dan detik ke-60 satu tetes PEG lagi, sehingga jumlah volume PEG yang diteteskan dalam satu menit adalah 1 ml. Penetesan PEG dilakukan sambil menggoyang tabung fusan. Pengaruh PEG 4000 dikurangi dengan menambahkan 9 ml medium DMEM-NBS sedikit demi sedikit menggunakan pipet ukur 10 ml dengan rentang waktu 5 menit. Pada menit ke-1.30 ke dalam tabung ditambahkan 1 tetes medium; menit ke-1.40 1 tetes; menit ke-1.50 1 tetes; dan menit ke-2 1 tetes. Selanjutnya, pada menit ke-2.40 ditambahkan lagi medium DMEM-NBS hingga pada pipet menunjukkan angka 1; pada menit ke-3.20 ditambahkan medium hingga angka 2; pada menit ke 4.00 ditambah 2 ml medium hingga angka 4; pada menit ke-4.40 ditambahkan medium 4 ml hingga angka 8, dan pada menit ke-5 ditambahkan sisa medium hingga angka 10. Selanjutnya suspensi sel fusan disentrifusi dengan kecepatan 1000 rpm selama 7 menit, supernatannya dibuang dan pelet dalam tabung konus disuspensikan kembali dengan menambahkan medium HAT (sesuai dengan hasil perhitungan). Kemudian suspensi didistribusikan ke dalam lubang cawan mikro (microplate) steril dan bertutup, 100 ml setiap lubang, dan cawan mikro diinkubasikan di dalam inkubator CO2 bersuhu 37oC.
Pada hari ke-2 dan selanjutnya hingga hari ke1-10 inkubasi, selang dua hari, ke dalam setiap lubang biakan ditambahkan 100 ml medium HAT. Kemudian pada hari ke-11 hingga ke-30 pertumbuhan sel hibridoma di setiap lubang cawan diamati dengan melihat koloni yang tumbuh di dasar lubang, dan lubang yang ditumbuhi sel hibridoma diberi tanda. Apabila koloni sel hibridoma sudah tumbuh kurang lebih 1/5 luasan dasar lubang, maka skring (seleksi) hibridoma penghasil McAb dilakukan.
Perawatan Sel Hibridoma Hasil Fusi Medium sel hibridoma diganti untuk pertama kalinya pada hari ke-5 setelah fusi dengan cara menganbil media sebanyak 100 ul/sumur dan digantikan dengan medium HAT baru sebanyak 100 ul/sumur. Penggantian medium selanjutnya dilakukan setiap 3 hari dengan medium HT (HAT tanpa Aminopterin). Sel hibridoma yang sudah terlalu banyak dalam pelat mikro 96 sumur harus segera dipindahkan ke dalam pelat mikro 24 sumur yang sudah berisi medium sebanyak 1 ml/sumur. Begitu pula jika sel dalam pelat mikro 24 sumur sudah penuh juga harus segera dipindahkan kedalam pelat mikro 6 sumur yang sudah berisi medium kultur sebanyak 2 ml/sumur.
Skrining Sel Hibridoma Hibridoma yang tumbuh diharapkan mensekresikan antibodi ke dalam medium, sehingga cairan medium tempat hibridoma tumbuh mengandung antibodi. Keberhasilan memperoleh hibridoma penghasil antibodi diperiksa dengan menguji dengan antigen yang bersangkutan menggunakan teknik Antigen Adsorption Indirect (AAI)-ELISA dan Indirect Double Antibody Sandwich (IDAS)-ELISA (Jumanto 1998; tidak dipublikasi). Sebagai antigen digunakan ekstrak daun padi terinfeksi RTV dan sediaan murni RS. Hasil reaksi ELISA diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 415 nm. Reaksi positif (>0) berarti hibridoma menghasilkan McAb. Akhirnya, lubang cawan biakan hibridoma yang menghasilkan McAb diberi tanda. Skrining hibridoma penghasil McAb dilakukan dua kali. Skrining I dilakukan untuk memperoleh hibridoma yang dapat menghasilkan McAb. Skrining II dilakukan dengan cara yang sama dengan skrining I, tetapi untuk memilih kembali sel hibridoma penghasil McAb yang potensial menghasilkan McAb tinggi dan stabil, dari koloni hibridoma penghasil McAb yang diperoleh pada seleksi I.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Produksi, Seleksi, dan Karakterisasi Sel Hibridoma Penghasil McAb RS
Hasil yang dicapai pada dua kegiatan, di mana antara kegiatan yang ke satu dengan kegiatan kedua diharapkan memiliki capaian yang sama, yaitu antibodi monoklonal yang spesifik terhadap RTV dan RS. Pada penelitian ini tahapan kegiatan yang dilakukan ada 6 enam tahapan, yaitu purifikasi antigen, immunisasi, penyediaan dan perbanyakan mieloma, fusi sel limposit dan sel mieloma, hibridisasi, skrining hibridoma. Hanya saja pada tahapan untuk mendapatkan antigen yang berbeda.
Pada kegiatan 2, antigen RS diperoleh dari hasil isolasi bakteri Ralstonia solanacearum dari tanaman kacang tanah yang berasal dari Bogor dan sekitarnya. Kemudian dilakukan seleksi terhadap ras patogen yang ada. Isolat ini diperbanyak dengan membiakkan pada cawan petri berisi medium Sukrose Pepton Agar (SPA) (Lelliot dan Stead 1987). Biakan R. solanacearum (Gambar3) umur 48 jam dipanen dengan menambahkan 10 ml akuades steril kedalam tiap cawan biakan.
Suspensi biakan ini diamati dengan menggunakan standart Mc. Farlan sampai diperoleh biakan dengan optikal densiti 107. Biakan dikeruk dengan jarum ose sambil diaduk, kemudian suspensi bakteri dipindahkan ke tabung sentrifus steril dan diaduk menggunakan vortex mixer hingga menjadi suspensi yang homogen. Selanjutnya suspensi bakteri ini dicuci tiga kali dengan larutan 0,1 N bufer fospat salin (Phosphate Buffered Saline, PBS) dengan pH 7,2 melalui sentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm masing-masing selama 10 menit. Akhirnya pelet bakteri disuspensikan kembali dalam PBS steril hingga kepekatannya +1010 sel/ml dan disimpan pada suhu -15oC untuk digunakan sebagai stok antigen. Sebelum imunisasi mencit, larutan stok antigen dicairkan, diambil sebagian untuk diencerkan dengan PBS steril sehingga kerapatan selnya +106-108 sel/ml. Enceran antigen ini digunakan untuk imunisasi mencit.
Imunisasi Mencit. Mencit (tikus putih) hibrida Balb/c yang diperoleh dari IPB, Bogor, digunakan imunisasi dengan sediaan murni RTV dan RS. Untuk RTV menggunakan enam ekor mencit dan untuk RS menggunakan 4 ekor mencit. Sediaan murni RTV dan RS yang digunakan sebagai antigen diperoleh dari hasil pemurnian yang telah dilakukan pada penelitian sebelumnya dan penelitian tahun 2004. Antigen RTV dan RS dilarutkan dalam bufer fosfat salin (Phosphate Buffered Saline, PBS), pH 7.2. Sebelum imunisasi, antigen dicampur dengan Ajuvan Freund Inkomplit (Incomplete Freund’s Ajuvant, Sigma) dengan perbandingan 1 : 1. Imunisasi dilakukan pada mencit umur 4 minggu dengan menyuntikkan 100 μl (10-20 ug) larutan antigen RTV dan RS setiap kali secara intraperitonial, melalui vena ekor mencit, secara berkala dengan tenggang waktu satu minggu. Imunisasi dilakukan empat kali. Pada saat imunisasi RTV kedua sebanyak tiga ekor mencit mati yang sisa 4 ekor (Tabel 1). Keadaan ini memicu untuk dilakukan modifikasi mengenai konsentrasi antigen yang akan diinjeksikan. Injeksi dilakukan dengan konsentrasi antigen RTV 5, 10, 15, dan 20 ug. Dari hasil optimasi konsentrasi antigen RTV yang baik untuk disuntikan adalah konsentrasi 10 ug.
Perbanyakan mieloma. Sel-sel mieloma diperbanyak dengan membiakkan dalam media RPMI 1640 yang mengandung NBS/FSC dan L-glutamine. Dari hasil beberapa optimasi diperoleh sel mieloma yang cukup banyak dan baik (Gambar 4). Pada fase pertumbuhan dihitung populasi sel nya. Saat ini sebanyak 57 ampul sel mieloma disimpan dalam kondisi kriogenik dalam tabung nitrgen cair, namun dalam proses mengaktifkan kembali sel dari ampul tersebut masih mengalami kendala di mana selnya banyak mengalami kematian. Sel yang tersisa sedang ditumbuhkan kembali untuk bahan fusi sel dalam medium DMEM. Saat ini bersamaan dengan pertumbuhan sel mieloma diupayakan juga perbanyakan mencit BALB C baru untuk bahan produksi sel limposit.
Sel Hibridoma Setelah dilakukan pencampuran sel mieloma dengan limposit mencit (fusi) diperoleh sel hibridoma (Gambar 5). Memasuki hari ke-15 pertumbuhan sel baru mencapai 1/10 luasan cawan. Hasil ini belum maksimal. Memasuki hari ke 20 pertumbuhan sel mengalami hambatan, hal inidikarenakan terjadi penurunan konsentrasi gas CO2 yang disebabkan terjadi kebocoran alat.Tahapan fusi sel perlu diulang kembali.
Skrining Sel Hibridoma Sel hibridoma yang tumbuh pada saat ini belum banyak sehingga skrining hibridoma penghasil MCAb RTV dan RS perlu diulang. Hal ini disebabkan karena jumlah sel hibridoma yang diharapkan sebanyak 1/5 dari luasan cawan petri belum didapat. Sel yang ada masih sedikit pertumbuhannya belum optimal dan terkendala dengan alat yang ada. Akan tetapi teknik perbanyakannya
sudah diperoleh hanya saja masih perlu dilakukan modifikasi. Proliferasi sel hasil fusi masih rendah sehingga belum memungkinkan untuk dilakukan skrining sel hibridoma. Skrining dilakukan untuk mengetahui titer antibodi sel hibridoma yang diperoleh dari hasil fusi mencit Balb/c dengan sel mieloma SP2. Pengujian spesifisitas antibodi merupakan hal penting pada produkasi antibodi monoklonal. Antibodi monoklonal yang spesifik menurut Morris dan Clifford (1985) hanya akan bereaksi dengan antigen pembentuknya. Antigen yang benar-benar spesifik sangat jarang ditemukan dikatakan pula bahwa sebagian besar antibodi bereaksi silang dengan metabolit, fragmen atau molekul-molekul lain yang memiliki kesamaan urutan asam amino. Reaksi silang terjadi karena kesamaan epitop antara bakteri maupun
virus. Sesama golongan masih dimungkinkan terjadi reaksi silang.
adalah antibodi sejenis yang diproduksi oleh sel plasma klon sel-sel positif sejenis. Antibodi ini dibuat oleh sel-sel hibridoma (hasil fusi 2 sel berbeda; penghasil sel positif Limpa danselmieloma)yangdikultur.Bertindak sebagai antigen yang akan menghasilkan anti bodi adalah limpa. Fungsi antara lain diagnosis penyakit dan kehamilan.Antibodi monoklonal adalah zat yang diproduksi oleh sel gabungan tipe tunggal yang memiliki kekhususan tambahan. Ini adalah komponen penting dari sistem kekebalan tubuh. Mereka dapat mengenali dan mengikat ke antigen yang spesifik. Pada teknologi antibodi monklonal, sel tumor yang dapat mereplikasi tanpa henti digabungkan dengan sel mamalia yang memproduksi antibodi. Hasil penggabungan sel ini adalah hybridoma, yang akan terus memproduksi antibodi. Antibodi monoklonal mengenali setiap determinan yang antigen (bagian dari makromolekul yang dikenali oleh sistem kekepalan tubuh / epitope). Mereka menyerang molekul targetnya dan mereka bisa memilah antara epitope yang sama. Selain sangat spesifik, mereka memberikan landasan untuk perlindungan melawan patogen. Antibodi monoklonal sekarang telah digunakan untuk banyak masalah diagnostik seperti : mengidentifikasi agen infeksi, mengidentifikasi tumor, antigen dan antibodi auto, mengukur protein dan level drug pada serum, mengenali darah dan jaringan, mengidentifikasi sel spesifik yang terlibat dalam respon kekebalan dan mengidentifikasi serta mengkuantifikasi hormon.
II.Cara Memproduksi Antibodi Monoklonal (Hibridoma)
PENERAPAN ANTIBODI MONOKLONAL
Makrofag telah mengidentifikasikan sel kanker. Ketika melampaui batas menyatukan dengan sel kanker, makrofag (sel putih yang lebih kecil) akan menyuntikan toksin yang akan membunuh sel tumor. Imunoterapi untuk perawatan kanker merupakan salah satu hal yang diteliti oleh penelitian medis.
Peran penting imunitas lainnya adalah untuk menemukan dan menghancurkan tumor. Sel tumor menunjukan antigen yang tidak ditemukan pada sel normal. Untuk sistem imun, antigen tersebut muncul sebagai antigen asing dan kehadiran mereka menyebabkan sel imun menyerang sel tumor. Antigen yang ditunjukan oleh tumor memiliki beberapa sumber; beberapa berasal dari virus onkogenik seperti papillomavirus, yang menyebabkan kanker leher rahim, sementara lainnya adalah protein organisme sendiri yang muncul pada tingkat rendah pada sel normal tetapi mencapai tingkat tinggi pada sel tumor. Salah satu contoh adalah enzim yang disebut tirosinase yang ketika ditunjukan pada tingkat tinggi, merubah beberapa sel kulit (seperti melanosit) menjadi tumor yang disebut melanoma.Kemungkinan sumber ketiga antigen tumor adalah protein yang secara normal penting untuk mengatur pertumbuhan dan proses bertahan hidup sel, yang umumnya bermutasi menjadi kanker membujuk molekul sehingga sel termodifikasi sehingga meningkatkan keganasan sel tumor. Sel yang termodifikasi sehingga meningkatkan keganasan sel tumor disebut onkogen.
Respon utama sistem imun terhadap tumor adalah untuk menghancurkan sel abnormal menggunakan sel T pembunuh, terkadang dengan bantuan sel T pembantu. Antigen tumor ada pada molekul MHC kelas I pada cara yang mirip dengan antigen virus. Hal ini menyebabkan sel T pembunuh mengenali sel tumor sebagai sel abnormal Sel NK juga membunuh sel tumor dengan cara yang mirip, terutama jika sel tumor memiliki molekul MHC kelas I lebih sedikit pada permukaan mereka daripada keadaan normal; hal ini merupakan fenomena umum dengan tumor. Terkadang antibodi dihasilkan melawan sel tumor yang menyebabkan kehancuran mereka oleh sistem komplemen.
Beberapa tumor menghindari sistem imun dan terus berkembang sampai menjadi kanker.Sel tumor sering memiliki jumlah molekul MHC kelas I yang berkurang pada permukaan mereka, sehingga dapat menghindari deteksi oleh sel T pembunuh. Beberapa sel tumor juga mengeluarkan produk yang mencegah respon imun; contohnya dengan mengsekresikan sitokin TGF-β, yang menekan aktivitas makrofag dan limfosit. Toleransi imunologikal dapat berkembang terhadap antigen tumor, sehingga sistem imun tidak lagi menyerang sel tumor.
Makrofag dapat meningkatkan perkembangan tumor ketika sel tumor mengirim sitokin yang menarik makrofag yang menyebabkan dihasilkannya sitokin dan faktor pertumbuhan yang memelihara perkembangan tumor. Kombinasi hipoksia pada tumor dan sitokin diproduksi oleh makrofag menyebabkan sel tumor mengurangi produksi protein yang menghalangi metastasis dan selanjutnya membantu penyebaran sel kanker.
Antibodi monoklonal adalah kelompok obat yang relatif baru, dan pengembangan terapi ini merupakan salah satu kemajuan terbesar untuk pengobatan limfoma non Hodgkin dalam beberapa tahun belakangan. Antibodi monoklonal yang paling umum dipakai dalam pengobatan limfoma non Hodgkin adalah rituximab. Rituximab efektif dalam pengobatan beberapa tipe limfoma non Hodgkin yang paling umum. Rituximab umumnya diberikan dalam kombinasi dengan kemoterapi, meskipun pada beberapa keadaan diberikan tunggal.
Pada banyak pasien, rituximab meningkatkan efektivitas dari pengobatan lain (umumnya kemoterapi). Pada limfoma non Hodgkin indolen, rituximab dapat meningkatkan lamanya masa remisi karena pengobatan. Pada limfoma non Hodgkin agresif, tambahan rituximab pada kemoterapi standar (CHOP) telah terbukti meningkatkan kemungkinan pasien untuk sembuh dan meningkatkan harapan hidup dibanding kemoterapi saja.
Juga penting bahwa efek samping terkait infus rituximab umumnya hanya terjadi saat obat diberikan dan berkurang pada dosis berikutnya, serta pemberian bersamaan dengan kemoterapi tidak menyebabkan peningkatan efek samping karena kemoterapi yang bermakna. Efek samping yang berlanjut lebih lama dari beberapa menit atau jam sangat jarang dan umumnya tidak ada makna klinisnya .
CARA KERJA ANTIBODI MONOKLONAL
Tidak seperti kemoterapi dan radioterapi, yang bekerja secara kurang spesifik, tujuan pengobatan antibodi monoklonal adalah untuk menghancurkan sel-sel limfoma non Hodgkin secara khusus dan tidak mengganggu jenis-jenis sel lainnya.
Semua sel memiliki penanda protein pada permukaannya, yang dikenal sebagai antigen. Antibodi monoklonal dirancang di laboratorium untuk secara spesifik mengenali penanda protein tertentu di permukaan sel kanker. Antibodi monoklonal kemudian berikatan dengan protein ini. Hal ini memicu sel untuk menghancurkan diri sendiri atau memberi tanda pada siinduk kekebalan tubuh untuk menyerang dan membunuh sel kanker.
Sebagai contoh, rituximab, antibodi monoklonal yang dipakai dalam pengobatan limfoma non Hodgkin, mengenali penanda protein CD20. CD20 ditemukan di permukaan Sel B abnormal yang ditemukan pada jenis-jenis limfoma non Hodgkin yang paling umum.
Saat rituximab berikatan dengan CD20 di permukaan suatu sel-B, sel mungkin dihancurkan langsung, tetapi pertahanan alami tubuh juga disiagakan. Rituximab secara efektif menyerang sel limfoma agar dapat dihancurkan siinduk kekebalan tubuh dan membunuh sel-sel kanker.
CD20 juga ditemukan di permukaan sel-B normal, salah satu jenis sel darah putih yang beredar di tubuh. Ini berarti mungkin sel-B normal ini juga dihancurkan saat rituximab digunakan. Akan tetapi, sel induk dalam sumsum tulang yang berkembang menjadi sel-B tidak memiliki CD20 pada permukaannya.
Oleh karena itu sel induk tidak dihancurkan oleh rituximab dan dapat terus menyediakan sel-B sehat untuk tubuh. Meskipun jumlah sel-B normal yang matang berkurang untuk sementara karena pengobatan, mereka akan kembali ke kadar semula setelah pengobatan.
DOSIS DAN PEMBERIAN ANTIBODI
Dosis dan pemberian bervariasi untuk setiap antibodi yang diberikan. Sebagai contoh, rituximab, antibodi monoklonal yang umum digunakan dalam pengobatan NHL diberikan intravena, melalui jarum yang masuk ke dalam pembuluh darah , biasanya di lengan. Rituximab diberikan sebagai ‘tetesan’ yang berarti obat dimasukkan dulu ke dalam kantong infus, kemudian cairan menetes perlahan ke dalam pembuluh darah dengan mengandalkan kekuatan gravitasi. Jika antibodi monoklonal digunakan dalam kombinasi dengan kemoterapi, rituximab biasanya diberikan sesaat sebelum kemoterapi pada awal setiap siklus pengobatan.
Sebelum tetesan infus diberikan, obat lain untuk mencegah beberapa efek samping antibodi monoklonal diberikan – contohnya parasetamol untuk mengurangi demam dan anti-histamin untuk mengurangi kemungkinan reaksi alergi. Meski demikian, efek samping antibodi monoklonal umumnya ringan dan sementara serta dapat diatasi dengan mudah.
Jika terjadi efek samping saat obat diberikan, tetesan infus dapat diperlambat atau bahkan dihentikan hingga efek samping berakhir.
Untuk pengobatan pertama, pasien menginap di rumah sakit atau sementara tinggal di sana sebelum pulang ke rumah. Pengobatan lanjutan biasanya lebih cepat dan efek sampingnya lebih sedikit. Kebanyakan orang dapat mendapat pengobatan lanjutan ini sebagai rawat-jalan dan pulang ke rumah pada hari itu juga.
EFEK SAMPING ANTIBODI MONOKLONAL
Seperti semua obat, antibodi monoklonal dapat menyebabkan efek samping. Contohnya untuk rituximab, efek samping umumnya ringan dan bersifat sementara, hanya berlangsung selama pengobatan atau beberapa jam setelahnya. Efek samping terjadi paling sering selama masa pengobatan mingguan pertama, dan biasanya berkurang dengan dosis selanjutnya. Hal ini disebabkan lebih banyak sel limfoma selama pengobatan pertama yang harus diserang oleh antibodi monoklonal dan dihancurkan oleh si induk kekebalan tubuh.
Efek samping yang paling umum adalah demam, menggigil dan gejala mirip flu lainnya, seperti nyeri otot, nyeri kepala dan rasa letih. Umumnya cepat berakhir setelah masa pengobatan berakhir. Kadang-kadang, pasien merasakan flushing mendadak dan merasa panas di wajah. Hal ini biasanya berlangsung amat singkat.
Beberapa pasien mengalami mual (mual) atau muntah. Obat anti muntah (anti-muntah) umumnya sangat efektif dalam mencegah maupun meringankan gejala-gejala ini sehingga lebih dapat ditoleransi.
Kadang-kadang, pasien merasakan nyeri pada bagian tubuh yang merupakan lokasi limfoma. Nyeri biasanya ringan dan dapat diatasi dengan obat anti-nyeri biasa.
Rituximab dapat menyebabkan reaksi alergi. Gejalanya dapat berupa:
• Gatal atau mendadak muncul warna kemerahan
• Batuk, mengi atau sesak napas
• Lidah bengkak atau rasa bengkak di tenggorokan
• Edema, atau pembengkakan karena kelebihan cairan dalam jaringan tubuh
Reaksi alergi berat terhadap rituximab jarang ditemukan dan pasien diamati selama masa pengobatan akan munculnya gejala-gejala ini. Pasien harus melaporkan gejala yang dialaminya begitu muncul. Seringkali, yang perlu dilakukan hanyalah memperlambat atau menghentikan sementara tetesan intravena sampai reaksi alergi berakhir. Pasien umumnya diberikan anti-histamin sebelum mulai pengobatan untuk membantu mencegah atau mengurangi masalah ini.
MATERI
Terapi antibodi monoklonal merupakan bentuk pasif dari imunoterapi, karena antibodi dibuat dalam kuantitas besar di luar tubuh (di laboratorium). Jadi terapi ini tidak membutuhkan sistem imun pasien untuk bersikap aktif melawan kanker. Antibodi diproduksi secara masal dalam laboratorium dengan menggabungkan sel myeloma (tipe kanker sumsum tulang) dari sel B mencit yang menghasilkan antibodi spesifik. Sel hasil penggabungan ini disebut hybridoma.
Kombinasi sel B yang bisa mengenali antigen khusus dan sel myeloma yang hidup akan membuat sel hibridoma menjadi semacam pabrik produksi antibodi yang tidak ada habisnya. Karena semua antibodi yang dihasilkan identik, berasal dari satu (mono) sel hibridoma, mereka disebut antibodi monoklonal (kadang disingkat MoAbs atau Mabs).
Nama MAb Nama Dagang Digunakan pada kanker Disetujui
Rituximab Rituxan Non-Hodgkin lymphoma 1997
Trastuzumab Herceptin Breast cancer 1998
Gemtuzumab ozogamicin* Mylotarg Acute myelogenous leukemia (AML) 2000
Alemtuzumab Campath Chronic lymphocytic leukemia (CLL) 2001
Ibritumomab tiuxetan* Zevalin Non-Hodgkin lymphoma 2002
Tositumomab* Bexxar Non-Hodgkin lymphoma 2003
Cetuximab Erbitux Colorectal cancer
Head & neck cancers 2004
2006
Bevacizumab Avastin Colorectal cancer 2004
Dua tipe antibodi monoklonal yang digunakan untuk terapi kanker, adalah :
1. Naked monoclonal antibodies
Naked monoclonal antibodies atau antibodi monoklonal murni adalah antibodi yang penggunaanya tanpa dikombinasikan dengan obat lain atau material radioaktif. Antibodi murni mengikatkan diri mereka pada antigen spesifik milik sel-sel kanker dengan berbagai cara. Misalnya, memberi tanda pada sel kanker agar bisa dikenali dan dirusak oleh sistem imun tubuh. Cara lain dengan mengikatkan diri pada antigen tertentu yang disebut reseptor, tempat di mana molekul-molekul yang berfungsi menstimulasi pertumbuhan sel kanker juga akan mengikatkan diri.
Dengan menghambat molekul-molekul pertumbuhan untuk tidak mengikatkan diri, maka antibodi monoklonal ini sama saja mencegah sel kanker untuk tumbuh dengan cepat. Trastuzumab (Herceptin), yang merupakan MAb murni dan digunakan untuk kanker payudara stadium lanjut, adalah contoh antibodi monoklonal yang bekerja dengan cara ini.
Beberapa MAbs murni yang sudah disetujui FDA antara lain :
• Rituximab (Rituxan): Rituximab digunakan untuk terapi sel B pada non-Hodgkin lymphoma. Agen ini merupakan antibodi monoklonal dengan sasaran antigen CD20, yang ditemukan pada sel B.
• Trastuzumab (Herceptin): Trastuzumab adalah antibodi yang menyerang protein HER2. Protein ini terlihat dalam jumlah besar pada sel-sel beberapa kasus kanker payudara.
• Alemtuzumab (Campath): Alemtuzumab merupakan antibodi yang menyerang antigen CD52, yang terlihat pada sel B maupun sel T. Agen ini digunakan untuk terapi B cell lymphocytic leukemia (B-CLL) kronik yang sudah mendapat kemoterapi.
• Cetuximab (Erbitux): Cetuximab, antibodi dengan sasaran protein EGFR (epidermal growth factor receptors). EFGR nampak dalam jumlah besar pada beberapa sel kanker. Agen ini digunakan berbarengan dengan obat kemoterapi irinotecan untuk kanker kolorektal stadium lanjut.
• Bevacizumab (Avastin): Bevacizumab bekerja melawan protein VEGF (Vascular Endhotelial Growth Factor) yang normalnya membantu tumor membangun jaringan pembuluh darah baru (proses angiogenesis) sebagai satu cara mendapatkan oksigen dan nutrisi.
Efek Samping
Antibodi monoklonal diberikan intravena. Dibandingkan dengan efek samping kemoterapi, efek samping naked MAbs atau MAbs murni biasanya lebih ringan dan sering dikaitkan dengan reaksi “alergi”. Efek ini terlihat biasanya di awal terapi, misalnya demam, menggigil, lemah, nyeri kepala, mual, muntah, diare, tekanan darah turun, dan rashes. Beberapa MAbs juga bisa berimbas pada sumsum tulang seperti halnya pada pemberian obat kemoterapi. Hal ini sebagai akibat rendahnya kadar sel darah. Efek samping ini bisa memicu peningkatan risiko pendarahan dan infeksi pada pasien.
` 2. Conjugated Monoclonal Antibodies
Conjugated monoclonal antibodies adalahantibodi yang dikombinasikan dengan berbagai jenis obat, toksin, dan materi-materi radioaktif. Antibodi monoklonal jenis ini akan berkeliling ke seluruh bagian tubuh sampai ia berhasil menemukan sel kanker yang cocok dengan antigen yang ia bawa. Agen ini kemudian akan menghantarkan racun di tempat paling krusial, namun hebatnya, ia bisa meminimalkan dosis pada sel normal untuk menghindari kerusakan di seluruh bagian tubuh.
Conjugated MAbs kadang dikenal juga sebagai "tagged," "labeled," atau "loaded" antibodies. Perbedaannya sebagai berikut:
• MAbs yang dikombinasikan dengan obat-obat kemoterapi disebut chemolabeled. Saat ini agen ini hanya tersedia di Amerika Serikat, itupun hanya dalam rangka uji klinis.
• MAbs yang dikombinasikan dengan partikel radioaktif disebut radiolabeled, dan tipe terapi ini sering juga disebut radioimmunotherapy (RIT). Pada 2002, FDA menyetujui radiolabeled pertama yang boleh digunakan untuk terapi kanker (tak hanya untuk uji klinis) yakni Ibritumomab tiuxetan (Zevalin). Obat ini digunakan untuk terapi kanker B lymphocytes. Di samping untuk kanker, antibodi radiolabeled juga digunakan bersamaan dengan kamera khusus untuk mendeteksi penyebaran sel kanker dalam tubuh. Penggunaannya sudah disetujui FDA yakni OncoScint (untuk deteksi kanker kolorektal dan kanker ovarium) serta ProstaScint (deteksi kanker prostat).
• MAbs yang melekat dengan racun disebut immunotoxins. Imunotoksin dibuat dengan menempelkan racun-racun (berasal dari tanaman maupun bakteri) ke antibodi monoklonal. Berbagai racun dibuat untuk ditempelkan pada antibosi monoklonal seperti diphtherial toxin (DT), pseudomonal exotoxin (PE40), atau yang dibuat dari tanaman yakni ricin A atau saporin.
Imunotoksin lain yakni BL22, juga cukup menjanjikan melalui studi awal untuk terapi hairy cell leukemia, bahkan pada pasien yang tidak menunjukkan respon sama sekali dengan kemoterapi. Uji klinis imunotoksin juga tengah berlangsung untuk jenis leukemia tertentu, limfoma, kanker otak, dan kanker lainnya.
1. Kombinasi Growth Factors/Toksin
Ilmuwan juga melakukan eksperimen dengan racun yang ada kaitannya dengan substansi serupa hormon, yang sering disebut growth factors. Banyak sel-sel kanker memiliki reseptor growth factor dalam jumlah besar di permukaan sel yang akan menstimulasi sel untuk reproduksi dan tumbuh dengan cepat.
Peneliti lantas mengupayakan kombinasi gen sehingga growth factor bisa menempel pada toksin. Saat kombinasi growth factors/toksin mencapai reseptor growth factor pada permukaan sel kanker, dia akan menyalurkan muatan racun ke dalam sel kanker dan membunuhnya. Konsep di belakang obat gabungan growth factors/toksin ini mirip dengan imunotoksin. Namun karena kombinasi growth factors/toksin ini tidak mengandung antibodi, obat ini tidak bisa diklasifikasikan sebagai imunotoksin.
2. Chimeric, Langkah Maju Terapi Antibodi Monoklonal
Hingga kini, keefektifan terapi MAb masih terbatas mengingat fakta bahwa antibodi diproduksi oleh sel-sel hibridoma mencit. Di awal terapi, antibodi ini seringkali bekerja baik. Namun pada beberapa kasus, sistem imun mulai mengenali antibodi mencit ini sebagai “benda asing” setelah pemberian beberapa kali, dan mulai merusaknya saat “musuh” ini masuk ke dalam tubuh.
Karena alasan ini, ilmuwan mengkombinasikan antibodi mencit yang bertanggungjawab untuk mengenali antigen tumor spesifik dengan bagian gen antibodi manusia. Produk gabungan antara gen antibodi manusia dan mencit ini disebut “chimeric” atau "humanized" monoclonal antibody.
3. Anti-angiogenesis
Anti-angiogenesis adalah proses penghentian pembentukan pembuluh darah baru. Pada jaringan normal, pembuluh darah baru terbentuk selama pertumbuhan dan perbaikan jaringan (misalnya ketika proses penyembuhan luka), dan selama perkembangan janin di masa kehamilan. Pembuluh darah membawa oksigen dan nutrisi ke jaringan yang diperlukan untuk pertumbuhan dan bertahan hidup. Demikian juga pada kanker. Tumor membutuhkan pembuluh darah untuk tumbuh dan bertahan hidup. Melalui proses yang kompleks, sel-sel endotel (yang membentuk pembuluh darah) bisa membelah diri dan tumbuh membentuk pembuluh darah baru. Proses ini disebut angiogenesis. Proses ini terjadi baik pada jaringan sehat maupun pada jaringan kanker.
Beberapa agen anti-angiogenesis yang sudah dikenal seperti dilansir American Association For Cancer Research, antara lain:
Bevacizumab
Seperti dipaparkan di atas, bevacizumab adalah antibodi monoklonal dengan target sasaran protein vascular endothelial growth factor (VEGF). Mei 2003, dari hasil penelitian fase III menunjukkan bahwa bevacizumab secara bermakna bisa meningkatkan harapan hidup hingga hampir 5 bulan pada pasien kanker kolorektal stadium lanjut. Agen ini dikombinasikan dengan kemoterapi berbasis IFL (irinotecan, 5-fluorouracil, dan leucovorin). Selain itu, risiko kematian dapat dikurangi lebih dari sepertiga (34%) pada kelompok pasien penerima kombinasi bevacizumab dan IFL dibandingkan pasien yang hanya menerima kemoterapi.
Thalidomide
Efek angiogenesis thalidomide pertama kali dibuktikan pada tahun 50-an, ketika perempuan hamil yang mengonsumsi obat ini mengalami phicomelia, atau deformitas kaki akibat penghambatan pembentukan pembuluh darah. Meskipun mekanisme persisnya belum diketahui, para ahli menjelaskan efek ini didapat dengan menghambat aksi faktor penting angiogenesis seperti basic fibroblast growth factor dan vascular endothelial growth factor (VEGF).
α-IFN
α-IFN, merupakan sitokin yang memiliki properti anti-angiogenesis yang sangat berperan dalam aktivitas penyakit seperti hemangioma, melanoma, renal cell carcinoma, dan Kaposi’s sarcoma. Beberapa laporan mengindikasikan, kombinasi α-IFN dengan agen lain seperti thalidomide atau cis-retinoic acid akan menghadirkan efek anti-angiogenesis yang lebih kuat.
MMP Inhibitors
Matrix metalloproteinases (MMPs) termasuk keluarga zinc-dependent endopeptidases yang bertanggungjawab menurunkan dan merombak dasar membran dan matriks ektraseluler. MMPs memegang peran penting dalam tahap perkembangan metastatik dan juga memfasilitasi neo-angiogenesis. Overekspresi dari MMPs oleh tumor atau stroma yang berkaitan dengan tumor berdampak pada prognosis yang memburuk pada beberpa jenis kanker termasuk kanker esofagus, kolon, dan pankreas.
Tyrosine Kinase Inhibitors
Kabanyakan sel, tremasuk sel kanker, memiliki resptor di permukaan mereka sebagai epidermal growth factor (EGF), yakni protein yang normalnya diproduksi oleh tubuh untuk pertumbuhan sel. Jika EGF berikatan dengan epidermal growth factor receptors (EGFRs), menyebabkan enzim tyrosine kinase menjadi aktif di dalam sel. Tyrosine kinase adalah enzim yang berada di dalam sel yang berfungsi mengikat fosfat dengan tirosin asam amino. Tyrosine kinase memicu proses kimia yang menyebabkan sel –termasuk sel kanker—tumbuh, berlipat ganda, dan menyebar. Penghambat tyrosin kinase (tyrosine kinase inhibitors) dikembangkan untuk menghentikan pertumbuhan sel kanker. Dari berbagai studi yang sudah dilakukan menunjukkan penghambat ini menyebabkan kematian sel dengan cepat, karena mekanisme bertahan hidup ala kanker di-deaktivasi.
Pengembangan Teknik Produksi dan Aplikasi Antibodi
Monoklonal Ralstonia Solanacearum (RS)
Penyakit layu bakteri yang disebabkan Ralstonia solanacearum (Rs) masih menjadi kendala produksi tanaman pertanian, misalnya pada kacang tanah, kentang, tomat, tembakau, pisang dan jahe. Bakteri RS bersifat soil born dan polifaga ini mempunyai variasi strain yang tinggi, baik berdasarkan kisaran inangnya, tingkat virulensinya, maupun kemampuan memanfaatkan karbohidrat sebagai nutrisinya (Machmud 1996). Beberapa mikroba patogen penting lainnya pada tanaman pangan dan hortikultura juga telah dikoleksi dalam plasma nutfah mikroba di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian Bogor. Komponen antigenik dari mikroba tersebut akan digunakan untuk produksi antibodi bagi pengembangan kit ELISA untuk deteksi dini dan identifikasi serangan penyakit.
Teknik serologi dan model perangkatnya dengan menggunakan antibodi poliklonal (PAb)dan monoklonal telah banyak dikembangkan untuk deteksi dan identifikasi virus dan bakteri patogen utama tanaman. Meskipun teknik ini cukup efektif, namun penggunaannya dianggap masihsangat mahal karena perangkat kit ELISA-nya masih tergantung pada produk impor. Di samping itu juga tidak mampu untuk mendeteksi adanya variasi strain patogen yang ada di lapang yang berkembang dengan sangat cepat dan bersifat spesifik lokasi. Melalui pembuatan perangkat kit
ELISA sendiri, permasalahan tersebut dapat teratasi. Teknik dan perangkat yang akan dikembangkandiharapkan dapat dimanfaatkan oleh peneliti dan pengguna lainnya, baik untuk keperluanpenelitian maupun untuk penggunaan secara rutin dan praktis, misalnya deteksi dini patogen di lapang dan deteksi patogen dari benih untuk keperluan karantina dan sertifikasi benih (Machmudet al. 1999).
Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan salah satu teknik serologi yang dapat digunakan untuk mendeteksi patogen tanaman secara efektif dan efisien (Halk dan De Boer 1985). Teknik ELISA dan perangkat deteksinya menggunakan antibodi poliklonal (PAb) atau McAb telah dikembangkan.secara komersial untuk deteksi virus dan bakteri patogen tanaman(Martin 1985; Van Regenmortel 1986). Teknik ELISA juga telah diadopsi di Indonesia, tetapi perangkatnya masih harus diimpor dengan harga mahal. menggunakan PAb (Machmud et al.1999).
Penggunaan PAb untuk uji ELISA memiliki beberapa kelemahan, sehingga sejak tahun1975, teknologi produksi antibodi monoklonal (monoclonal antibody, McAb) telah dikembangkan (Kohler dan Milsten 1975; Carter dan Ter Meulen 1984; Gigerli dan Fries 1983). McAb dari PAb diantaranya (1) reaksi McAb dapat dibuat spesifik strain, dari satu patogen dapat dibuat beberapa McAb dengan spesifikasi tertentu sesuai kebutuhan; (2) antibodi yang dihasilkan mempunyai kualitas yang stabil serta berkesinambungan; (3) pasokan antibodi dalam jumlah besar mudah dilakukan, dan (4) teknologi McAb hanya modal awal yang relatif mahal, tetapi selanjutnya menjadi murah (Jordan 1990). McAb telah diproduksi untuk berbagai patogen tanaman termasuk virus, fitoplasma, dan bakteri (Converse dan Martin 1990; McLaughlin dan Chen 1990).
Pada tahun 1975 Kohler dan Milsten (dalam Jordan 1990a) memperkenalkan teknik pembiakan sel penghasil antibodi melalui fusi dengan sel mieloma, sehingga dapat menghasilkan antibodi yang homogen secara terus menerus, bereaksi serologi yang spesifik serta memiliki ciriciri biokomia tertentu pula. Hibridisasi sel-sel limposit penghasil antibodi dengan sel miolema (malignant myeloma cells) menghasilkan sel-sel hibridoma yang menggabungkan sifat-sifat parental dan kemampuan menghasilkan (mensekresi) antibodi yang spesifik dan terus tumbuh berkembangbiak. Kloning dan seleksi lebih lanjut sel-sel hibridoma memberi peluang diproduksinya mAb dengan spesifisitas yang sama (identik) dan efektifitas sesuai dengan yang diinginkan terhadap epitop tertentu pada antigen yang digunakan untuk imunisasi (Jordan 1990b). Akhirakhir ini teknik produksi mAb telah diadopsi untuk produksi mAb patogen tanaman. MAb telah digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi patogen tumbuhan termasuk virus, fitoplasma,dan bakteri (Converse dan Martin 1990; McLaughlin dan Chen 1990).
Kelebihan teknik produksi mAb dari teknik pAb di antaranya (1) mampu menghasilkan antibodi dalam jumlah relatif tidak terbatas, (2) kemampuan melestarikan produksi Ab yang spesisik melalui penyimpanan kriogenik hibridoma untuk waktu tidak terbatas, (3) kemampuan memproduksi dan menyeleksi mAb untuk hampir semua determinan antigenik meskipun antigen yang digunakan untuk imunisasi tidak murni atau merupakan campuran (Jordan 1990a dan 1990b; De Boer 1990). Teknologi hibridoma untuk produksi mAb telah diterapkan pada virologi dan bakteriologi tumbuhan. McAb sangat bermanfaat untuk identifikasi esei kualitatif bakteri dan virus tanaman, membedakan tingkat kesamaan antara anggota berbagai kelompok virus dan bakteri, serta mempelajari struktur dan fungsi produk gen (Converse dan Martin 1990).
Metodologi yang mencakup pembuatan galur sel (cell lines) yang menghasilkan mAb secara permanen relatif sederhana, tetapi memerlukan tahapan yang panjang dan seringkali sulit (crucial). Keberhasilan produksi mAb tidak hanya bergantung pada produksi galur sel hibridoma dalam jumlah banyak, tetapi juga pada keberhasilan imunisasi hewan donornya, pengetahuan dan pengalaman dasar tentang kultur sel (termasuk pembuatan medium, pemeliharaan, dan penyimpanan galur sel), dan pengembangan teknik serologi yang relatif sederhana, cepat, dan akurat untuk mengkarakterisasi dan mengidentifikasi antibodi. Penyediaan dan karakterisasi mAb untuk berbagai antigen tanaman dan patogen dapat dilakukan. Berbagai publikasi tentang teknik produksi mAb dapat digunakan sebagai bahan acuan (Jordan 1990a).
Hibridoma merupakan sel yang mudah rusak, memerlukan pengamatan mikroskopik untuk mengetahui viabilitas dan laju pertumbuhannya. Persyaratan lain untuk produksi McAb adalah antigen dan esei serologis yang digunakan untuk mengidentifikasi dan karakterisasi antibodi hibridoma. Sistem esei yang digunakan sangat tergantung pada jenis antigen dan rencana penggunaan McAb (Jordan 1990a).
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kelti Biokimia, BB-Biogen, Bogor. Peralatan dan bahan yang digunakan dalam penelitian di antaranya ialah ruang isolasi (laminar air flow), inkubator CO2 bersuhu 37oC, mikroskop (inverted microscope), sentrifus meja, otoklaf, waterbath 37- 56oC, alat penyimpanan kriogenik, alat kering beku (freeze dryer), pendingin (freezer) -15oC dan -80oC, hemasitometer, spektrofotometer, mikropipet 0-200 μl, mikropipet 1000 μl, multipipettor 8 lubang, filter milllipore ukuran 0,22 μm. Peralatan dan bahan untuk membiakkan sel hibridoma adalah cawan kultur sel (microplate) bertutup dengan 96 lubang; botol kultur sel berdiameter 25, 75, dan 150 cm; pipet gelas atau pipet plastik berukuran 1, 5, 10, dan 25 ml; ampul berukuran 1 ml; tabung sentrifus bertutup ukuran 5, 15, dan 50 ml; cawan petri bulat dan persegi, pipet pastur, sarung tangan plastik, spuit plastik berukuran 1, 10, dan 50 ml; jarum suntik berukuran 26G dan 16G, serta gunting operasi. Di samping peralatan laboratorium, mencit (tikus putih) hibrida Balb/c, serta ruangan dan kandang untuk pemeliharaannya juga diperlukan. Mencit sebagai hewan untuk diimunisasi dan sumber limposit. Bahan-bahan untuk pembuatan sediaan limposit, biakan sel mieloma, dan biakan sel hibridoma adalah Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), medium Hypoxanthine Aminopterine Thymidine (HAT), antibiotik kanamisin, serum albumin anak sapi yang baru lahir (Newly-borne Calf Serum, NBS), dan medium Hypoxanthine Thymidine (HT).
Penyediaan Antigen Contoh tanaman padi terinfeksi RTV dan RS diperoleh dari koleksi yang ada di Kelti Biokimia, BB-Biogen, yang semula berasal dari lapang di Sukamandi, Subang dan Serang.Pemurnian RTV dan RS dilakukan menggunakan teknik pemurnian menurut Saito (1983) yang dimodifikasi.
Imunisasi Mencit Mencit hibrida Balb/c yang diperoleh dari IPB, Bogor, digunakan untuk diimunisasi. Sediaan murni RS yang digunakan sebagai antigen diperoleh dari hasil pemurnian yang telah dilakukan sebelumnya. Antigen RS dilarutkan dalam bufer fosfat salin (Phosphate Buffered Saline, PBS), pH 7,2, dengan kepekatan 100 ug/ml. Sebelum imunisasi, antigen dicampur dengan Ajuvan Freund Inkomplit (Incomplete Freund’s Ajuvant, Sigma) dengan perbandingan 1 : 1. Imunisasi danbooster dilakukan sesuai dengan metode Harlow dan Lane (1988) dengan cara sebagai berikut: antigen RS diberikan secara intraperitonial (i.p) dengan dosis yang dilaporkan tidak mematikan tetapi imunogen (Dewanti-Hariyadi et al. 1998), yaitu 25 μg patogen/mencit. Mencit yang digunakan berumur 4-6 minggu dengan menyuntikkan 100 μl (10-20 ug) larutan antigen RS setiap kali secara intravenal, melalui vena ekor mencit, secara berkala dengan tenggang waktu satu minggu.Pada minggu 2, 3, 4, 5, dan 6 setelah imunisasi diberikan booster, yaitu penyuntikan dengan IFA (incomplete Freund’s adjuvant) secara intraperitonial (i.p). Tiga hari sebelum mencit disakritifikasi untuk diambil limfanya diberikan booster akhir secara intravena (IV) dengan konsentrasi 10 μg antigen/mencit.
Persiapan Sel Limposit dari Sel Limpa Mencit Hiperimun Persiapan sel limfosit dilakukan dengan metode Harlow dan Lane (1988) yang dimodifikasi.Mencit Balb/c yang sudah diinjeksi antigen RS serta sudah dibooster 4 kali dan diberi booster akhir secara i.v (umur 6 minggu setelah imunisasi) dimatikan dan direndam dalam alkohol 70%. Limpa diambil secara aseptik dan dicuci 3 kali dengan media DMEM tanpa serum. Cara lain yang juga dilakukan untuk mendapatkan sel limfosit adalah empat hari setelah imunisasi terakhir, 1 ml contoh darah diambil dari mencit yang telah diimunisasi, dipisahkan dan diuji kandungan (titer) antiserumnya menggunakan teknik mikropresipitasi. Apabila hasilnya positif dan titernya cukup tinggi, maka mencit dimatikan dan limpanya (spleen) diambil secara aseptik dan ditempatkan dalam cawan petri steril berisi 20 ml medium DMEM tanpa serum NBS (DMEM-NBS). Selanjutnya, secara aseptik pula, limpa yang masih utuh dan segar dipotong kecil-kecil untuk mengeluarkan sel limpa (limposit). Potongan-potongan limpa di tekan-tekan (diurut) menggunakan pinset untuk mengeluarkan limpositnya ke dalam medium. Suspensi limposit disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 7 menit dan peletnya dicuci dengan DMEM-NBS empat kali. Selanjutnya limposit disuspensikan kembali dengan 20 ml DMEM-NBS dan dihitung kerapatannya menggunakan hemasitometer. Pada percobaan ini digunakan lima ekor yang masing-masing diimunisasi dengan 100 ug antigen RS/injeksi.
Persiapan Sel Mieloma Pada hari ke-2 inkubasi, kondisi pertumbuhan, dan kerapatan sel biakan mieloma SP2 diperiksa. Diperkirakan dua hari ini sel mieloma tumbuh pada fase log. Contoh biakan diambil dari masing-masing cawan petri dan jumlah selnya dihitung menggunakan hemositometer. Bila jumlah sel yang dibutuhkan belum mencukupi, maka disediakan biakan baru dengan menumbuhkan sel mieloma yang telah ada dalam cawan petri yang berisi media baru. Pada hari ke-3 inkubasi, populasi sel mieloma diperiksa kembali dan dihitung kerapatannya, dan pada hari ke-4 inkubasi dilakukan fusi sel. Selanjutnya sel mieloma yang telah ditumbuhkan hingga fase pertumbuhan logaritmik disentrifusi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan disuspensikan kembali dalam 20 ml medium DMEM-serum free dengan volume tertentu dan kerapatan selnya dihitung dengan hemasitometer.
Fusi Limfosit dengan Mieloma Fusi dilakukan dengan cara mencampurkan sel mieloma dengan sel limfosit mencit, dengan perbandingan 10 : 1. Campuran sel disentrifusi dengan kecepatan 1000 rpm pada suhu kamar selama 7 menit. Selanjutnya supernatan dibuang. Ke dalam tabung berisi pelet sel fusan ditambahkan 1 ml larutan 50% polietilen glikol (PEG 4000) dalam DMEM-NBS, setetes demi setetes menggunakan pipet ukur 1 ml sambil digoyang. Penambahan tersebut, mulai dari tetesan pertama hingga tetesan terakhir, harus dilakukan dalam rentang waktu 60 detik. Tahapan pemberian PEG adalah sebagai berikut: detik ke-1 diteteskan satu tetes PEG, detik ke-10 satu tetes
PEG, detik ke-20 satu tetes PEG, detik ke-30 satu tetes PEG, dan detik ke-60 satu tetes PEG lagi, sehingga jumlah volume PEG yang diteteskan dalam satu menit adalah 1 ml. Penetesan PEG dilakukan sambil menggoyang tabung fusan. Pengaruh PEG 4000 dikurangi dengan menambahkan 9 ml medium DMEM-NBS sedikit demi sedikit menggunakan pipet ukur 10 ml dengan rentang waktu 5 menit. Pada menit ke-1.30 ke dalam tabung ditambahkan 1 tetes medium; menit ke-1.40 1 tetes; menit ke-1.50 1 tetes; dan menit ke-2 1 tetes. Selanjutnya, pada menit ke-2.40 ditambahkan lagi medium DMEM-NBS hingga pada pipet menunjukkan angka 1; pada menit ke-3.20 ditambahkan medium hingga angka 2; pada menit ke 4.00 ditambah 2 ml medium hingga angka 4; pada menit ke-4.40 ditambahkan medium 4 ml hingga angka 8, dan pada menit ke-5 ditambahkan sisa medium hingga angka 10. Selanjutnya suspensi sel fusan disentrifusi dengan kecepatan 1000 rpm selama 7 menit, supernatannya dibuang dan pelet dalam tabung konus disuspensikan kembali dengan menambahkan medium HAT (sesuai dengan hasil perhitungan). Kemudian suspensi didistribusikan ke dalam lubang cawan mikro (microplate) steril dan bertutup, 100 ml setiap lubang, dan cawan mikro diinkubasikan di dalam inkubator CO2 bersuhu 37oC.
Pada hari ke-2 dan selanjutnya hingga hari ke1-10 inkubasi, selang dua hari, ke dalam setiap lubang biakan ditambahkan 100 ml medium HAT. Kemudian pada hari ke-11 hingga ke-30 pertumbuhan sel hibridoma di setiap lubang cawan diamati dengan melihat koloni yang tumbuh di dasar lubang, dan lubang yang ditumbuhi sel hibridoma diberi tanda. Apabila koloni sel hibridoma sudah tumbuh kurang lebih 1/5 luasan dasar lubang, maka skring (seleksi) hibridoma penghasil McAb dilakukan.
Perawatan Sel Hibridoma Hasil Fusi Medium sel hibridoma diganti untuk pertama kalinya pada hari ke-5 setelah fusi dengan cara menganbil media sebanyak 100 ul/sumur dan digantikan dengan medium HAT baru sebanyak 100 ul/sumur. Penggantian medium selanjutnya dilakukan setiap 3 hari dengan medium HT (HAT tanpa Aminopterin). Sel hibridoma yang sudah terlalu banyak dalam pelat mikro 96 sumur harus segera dipindahkan ke dalam pelat mikro 24 sumur yang sudah berisi medium sebanyak 1 ml/sumur. Begitu pula jika sel dalam pelat mikro 24 sumur sudah penuh juga harus segera dipindahkan kedalam pelat mikro 6 sumur yang sudah berisi medium kultur sebanyak 2 ml/sumur.
Skrining Sel Hibridoma Hibridoma yang tumbuh diharapkan mensekresikan antibodi ke dalam medium, sehingga cairan medium tempat hibridoma tumbuh mengandung antibodi. Keberhasilan memperoleh hibridoma penghasil antibodi diperiksa dengan menguji dengan antigen yang bersangkutan menggunakan teknik Antigen Adsorption Indirect (AAI)-ELISA dan Indirect Double Antibody Sandwich (IDAS)-ELISA (Jumanto 1998; tidak dipublikasi). Sebagai antigen digunakan ekstrak daun padi terinfeksi RTV dan sediaan murni RS. Hasil reaksi ELISA diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 415 nm. Reaksi positif (>0) berarti hibridoma menghasilkan McAb. Akhirnya, lubang cawan biakan hibridoma yang menghasilkan McAb diberi tanda. Skrining hibridoma penghasil McAb dilakukan dua kali. Skrining I dilakukan untuk memperoleh hibridoma yang dapat menghasilkan McAb. Skrining II dilakukan dengan cara yang sama dengan skrining I, tetapi untuk memilih kembali sel hibridoma penghasil McAb yang potensial menghasilkan McAb tinggi dan stabil, dari koloni hibridoma penghasil McAb yang diperoleh pada seleksi I.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Produksi, Seleksi, dan Karakterisasi Sel Hibridoma Penghasil McAb RS
Hasil yang dicapai pada dua kegiatan, di mana antara kegiatan yang ke satu dengan kegiatan kedua diharapkan memiliki capaian yang sama, yaitu antibodi monoklonal yang spesifik terhadap RTV dan RS. Pada penelitian ini tahapan kegiatan yang dilakukan ada 6 enam tahapan, yaitu purifikasi antigen, immunisasi, penyediaan dan perbanyakan mieloma, fusi sel limposit dan sel mieloma, hibridisasi, skrining hibridoma. Hanya saja pada tahapan untuk mendapatkan antigen yang berbeda.
Pada kegiatan 2, antigen RS diperoleh dari hasil isolasi bakteri Ralstonia solanacearum dari tanaman kacang tanah yang berasal dari Bogor dan sekitarnya. Kemudian dilakukan seleksi terhadap ras patogen yang ada. Isolat ini diperbanyak dengan membiakkan pada cawan petri berisi medium Sukrose Pepton Agar (SPA) (Lelliot dan Stead 1987). Biakan R. solanacearum (Gambar3) umur 48 jam dipanen dengan menambahkan 10 ml akuades steril kedalam tiap cawan biakan.
Suspensi biakan ini diamati dengan menggunakan standart Mc. Farlan sampai diperoleh biakan dengan optikal densiti 107. Biakan dikeruk dengan jarum ose sambil diaduk, kemudian suspensi bakteri dipindahkan ke tabung sentrifus steril dan diaduk menggunakan vortex mixer hingga menjadi suspensi yang homogen. Selanjutnya suspensi bakteri ini dicuci tiga kali dengan larutan 0,1 N bufer fospat salin (Phosphate Buffered Saline, PBS) dengan pH 7,2 melalui sentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm masing-masing selama 10 menit. Akhirnya pelet bakteri disuspensikan kembali dalam PBS steril hingga kepekatannya +1010 sel/ml dan disimpan pada suhu -15oC untuk digunakan sebagai stok antigen. Sebelum imunisasi mencit, larutan stok antigen dicairkan, diambil sebagian untuk diencerkan dengan PBS steril sehingga kerapatan selnya +106-108 sel/ml. Enceran antigen ini digunakan untuk imunisasi mencit.
Imunisasi Mencit. Mencit (tikus putih) hibrida Balb/c yang diperoleh dari IPB, Bogor, digunakan imunisasi dengan sediaan murni RTV dan RS. Untuk RTV menggunakan enam ekor mencit dan untuk RS menggunakan 4 ekor mencit. Sediaan murni RTV dan RS yang digunakan sebagai antigen diperoleh dari hasil pemurnian yang telah dilakukan pada penelitian sebelumnya dan penelitian tahun 2004. Antigen RTV dan RS dilarutkan dalam bufer fosfat salin (Phosphate Buffered Saline, PBS), pH 7.2. Sebelum imunisasi, antigen dicampur dengan Ajuvan Freund Inkomplit (Incomplete Freund’s Ajuvant, Sigma) dengan perbandingan 1 : 1. Imunisasi dilakukan pada mencit umur 4 minggu dengan menyuntikkan 100 μl (10-20 ug) larutan antigen RTV dan RS setiap kali secara intraperitonial, melalui vena ekor mencit, secara berkala dengan tenggang waktu satu minggu. Imunisasi dilakukan empat kali. Pada saat imunisasi RTV kedua sebanyak tiga ekor mencit mati yang sisa 4 ekor (Tabel 1). Keadaan ini memicu untuk dilakukan modifikasi mengenai konsentrasi antigen yang akan diinjeksikan. Injeksi dilakukan dengan konsentrasi antigen RTV 5, 10, 15, dan 20 ug. Dari hasil optimasi konsentrasi antigen RTV yang baik untuk disuntikan adalah konsentrasi 10 ug.
Perbanyakan mieloma. Sel-sel mieloma diperbanyak dengan membiakkan dalam media RPMI 1640 yang mengandung NBS/FSC dan L-glutamine. Dari hasil beberapa optimasi diperoleh sel mieloma yang cukup banyak dan baik (Gambar 4). Pada fase pertumbuhan dihitung populasi sel nya. Saat ini sebanyak 57 ampul sel mieloma disimpan dalam kondisi kriogenik dalam tabung nitrgen cair, namun dalam proses mengaktifkan kembali sel dari ampul tersebut masih mengalami kendala di mana selnya banyak mengalami kematian. Sel yang tersisa sedang ditumbuhkan kembali untuk bahan fusi sel dalam medium DMEM. Saat ini bersamaan dengan pertumbuhan sel mieloma diupayakan juga perbanyakan mencit BALB C baru untuk bahan produksi sel limposit.
Sel Hibridoma Setelah dilakukan pencampuran sel mieloma dengan limposit mencit (fusi) diperoleh sel hibridoma (Gambar 5). Memasuki hari ke-15 pertumbuhan sel baru mencapai 1/10 luasan cawan. Hasil ini belum maksimal. Memasuki hari ke 20 pertumbuhan sel mengalami hambatan, hal inidikarenakan terjadi penurunan konsentrasi gas CO2 yang disebabkan terjadi kebocoran alat.Tahapan fusi sel perlu diulang kembali.
Skrining Sel Hibridoma Sel hibridoma yang tumbuh pada saat ini belum banyak sehingga skrining hibridoma penghasil MCAb RTV dan RS perlu diulang. Hal ini disebabkan karena jumlah sel hibridoma yang diharapkan sebanyak 1/5 dari luasan cawan petri belum didapat. Sel yang ada masih sedikit pertumbuhannya belum optimal dan terkendala dengan alat yang ada. Akan tetapi teknik perbanyakannya
sudah diperoleh hanya saja masih perlu dilakukan modifikasi. Proliferasi sel hasil fusi masih rendah sehingga belum memungkinkan untuk dilakukan skrining sel hibridoma. Skrining dilakukan untuk mengetahui titer antibodi sel hibridoma yang diperoleh dari hasil fusi mencit Balb/c dengan sel mieloma SP2. Pengujian spesifisitas antibodi merupakan hal penting pada produkasi antibodi monoklonal. Antibodi monoklonal yang spesifik menurut Morris dan Clifford (1985) hanya akan bereaksi dengan antigen pembentuknya. Antigen yang benar-benar spesifik sangat jarang ditemukan dikatakan pula bahwa sebagian besar antibodi bereaksi silang dengan metabolit, fragmen atau molekul-molekul lain yang memiliki kesamaan urutan asam amino. Reaksi silang terjadi karena kesamaan epitop antara bakteri maupun
virus. Sesama golongan masih dimungkinkan terjadi reaksi silang.
Sumber : http://hayatipelita.blogspot.com/2009/11/sistem-peredaran-darah.html
HIBRIDOMA - KENDALANYA
Antibody monoklonal dibentuk dengan cara Hibridoma , sehingga hasil antybody tidak terjadi kontaminasi Jenis lain seperti Antobody multiklonal
Sampai saat ini antibody monoklonal hanya dapat diproduksi dengan teknologi hibridoma.
Masalahnya teknologi hibridoma memiliki kelemahan antara lain :
1. Stabilitas genetik rendah dan risiko terhadap kontaminasi tinggi2. Kualitas dan kuantitas antibody yang dihasilkan rendah
3. Mahal karena menggunakan bahan dan alat kultur sel mamalia
4. Rekayasa genetika tidak dapat dilakukan
5. Produk akhir berupa antibody utuh padahal hanya diperlukan Fab
Dasar-dasar stem cell
Langganan:
Postingan (Atom)